大肠杆菌生产制备重组人胰岛素工艺

1.提取目的基因:

既从人的DNA 中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA 中分离.

2.提取质粒:

使用细胞工程,培养大肠杆菌,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状DNA.

3.基因重组:

取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA 连接酶将目的基因与质粒"缝合",形成一个能表达出胰岛素的DNA 质粒.

4.将质粒送回大肠杆菌:

再大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+ 的物质,如CaCl2 ,这使细胞会吸收外源基因此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.

5.胰岛素的产生:

再大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!

〖学习要求〗知道DNA的粗提取与鉴定的原理；掌握并能分析DNA粗提取的技术方法和要求；学会DNA分子的鉴定方法

【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

一、基础知识

活动1】阅读教材P54“基础知识”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）提取生物大分子的基本思路是利用它们的理化性质的不同进行分离。

2．（记忆）DNA的溶解性特点：

DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精而蛋白质溶于酒精。

【思考1】据图5－1 分析：

DNA在不同浓度NaCl 溶液中溶解度有何特点？在0.14mol/L 时溶解度最小；

要使DNA溶解，需要使用什么浓度？较高浓度，可使DNA溶解；

要使DNA析出，又需要使用什么浓度？0.14mol/L 可使DNA析出。【思考2】利用DNA不溶于酒精的原理，可以达到将DNA和蛋白质进一步分离目的。

3．（记忆）DNA的耐受性特点：

蛋白酶能分解蛋白质而不能分解DNA；在60～80℃时蛋白质变性沉淀而DNA 分子不变性。洗涤剂能与蛋白质结合瓦解细胞膜而不破坏DNA分子。

4．（记忆）DNA的鉴定原理

当鉴定提取出的物质是否是DNA时，需要使用二苯胺（甲基绿）进行鉴定。在沸水浴条件下，该试剂与DNA反应，呈现（浅）蓝色。

、实验设计

【活动2】阅读教材P55“实验设计”，讨论并回答下列问题：1．（记忆）实验材料的选取：选取材料时应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。

【思考3】你认为教材提供的材料中哺乳动物的血液不适合提取DNA。2．（记忆）破碎细胞，获取含DNA的滤液：

鸡血：向鸡血细胞液中加入一定量蒸馏水并玻棒搅拌，用纱布过滤后，收集滤液。

洋葱：向研钵中加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，用纱布过滤后，收集滤液。

【思考4】在以上实验中，蒸馏水的作用是使血细胞大量吸水而胀裂，洗涤剂的作用是瓦解细胞膜，食盐的作用是溶解DNA物质。3．（学会）去除滤液中的杂质：

方案一：30mL滤液→加NaCl 使DNA溶解→过滤得滤液→加蒸馏水

使DNA析出→过滤得过滤物→放到2mol/LNaCl 溶液中溶解

→ DNA－NaCl 溶解液

方案二：30mL滤液→加嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10 分钟→得DNA滤液

方案三：30mL滤液→ 60～67℃处理→过滤得DNA滤液

思考5】以上三个方案的原理分别是什么？

方案一原理： DNA 在不同浓度 NaCl 溶液中溶解度不同；

方案二原理：蛋白酶分解蛋白质，不分解 DNA ；

方案三原理： DNA 耐高温而蛋白质不耐高温。

【思考 6】方案一中：“加 NaCl 使 DNA 溶解→过滤得滤液”的目的是除去不溶 （可溶、不溶）于 NaCl 溶液中的细胞杂质；“加蒸馏水使 DNA 析出→过滤得 过滤物”的目的是除去可溶（可溶、不溶）于 NaCl 溶液中的细胞杂质。

4．（记忆） DNA 的析出：

DNA 滤液与等体积冷却酒精混合， 静置一段时间后析出的白色丝状物就是 DNA 。

5．（记忆） DNA 的鉴定： 取 2 支洁净的试管，编号甲、乙，各加

入等量的 2mol/L NaCl 溶液。甲中放 入少量白色丝状物，使之溶解。在甲、乙试管中各加 4mL 二苯胺，混合均匀。沸

水浴 5min ，观察颜色变化，甲试管呈现蓝色

、操作提示

注意事项： 1．在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心后除去血浆，以提高细胞

活动 3】（记忆）阅读教材 P56“操作提示”和 P57“课题延伸”，关注下列

悬液浓度

2．实验中使用塑料烧杯和尼龙布，以免DNA被吸附。

3．玻棒沿同一方向缓慢搅拌（细胞破裂时快速搅拌），玻棒不要碰到烧杯壁。

4．二苯胺试剂要现用现配。

5．为提高DNA纯度，实验中通常使用的洗涤剂有CTAB、SDS等。

【活动4】观看视频：观看“ DNA的粗提取与鉴定”视频，体会并学会相关技术

方法。

课后学习〗

1．尝试从植物组织中提取DNA分子。

2．基础训练册：将基础知识整理到作业本上；完成该节训练题。

〖学习要求〗

尝试PCR技术的基本操作，体验PCR技术的分子生物学实验方法；

理解PCR技术的原理；讨论PCR技术的应用

【预习指导】在课前时间通过阅读教材、同学交流和讨论，完成下列问题，并初步巩固。

一、基础知识

活动1】阅读教材P58“PCR原理”，讨论并回答下列问题：

1．（记忆）PCR技术扩增DNA的过程与细胞内的DNA复制过程类似思考1】填写下表：（记忆）细胞内DNA复制条件分析

2．（理解）细胞内DNA的复制

1）DNA的结构：脱氧核苷酸分子通过3,5 －磷酸二酯键连接形成核苷酸长链，

两条脱氧核苷酸长链反向平行排列并螺旋化，形成DNA双螺旋结构。

2）DNA的复制：首先，在解旋酶的作用下，由ATP供能，DNA发生解旋形成两条DNA单链。其次，在DNA单链的3'端，在RNA聚合酶在作用下，合成RNA 引物。再次，在DNA聚合酶的作用下，从引物的3'端开始合成DNA子链。最后，DNA聚合酶将引物切去，