植物愈伤组织诱导与植株再生培养体系建立

3·2 灭菌处理
1、小麦未成熟胚愈伤组织
取小麦受精后15~20天未成熟籽粒，用自来水洗净，在 天未成熟籽粒，用自来水洗净， 取小麦受精后 天未成熟籽粒 超净工作台上用70%乙醇浸泡 乙醇浸泡30s，弃掉 乙醇， 超净工作台上用 乙醇浸泡 ，弃掉70%乙醇，用无菌 乙醇 水冲洗3次 在用0·1%HgCl2灭菌 灭菌8min，弃掉 水冲洗 次，在用 灭菌 ，弃掉0·1%HgCl2， ， 用无菌水反复冲洗5~6次后备用 用无菌水反复冲洗 次后备用
三、实验
3·1 材料及仪器
超净工作台、恒温培养室、高温灭菌器、胚钩和放大镜、 超净工作台、恒温培养室、高温灭菌器、胚钩和放大镜、 直径9cm的培养皿、50ml与500ml(或250ml)三角瓶、50ml 的培养皿、 三角瓶、 直径 的培养皿 与 或 三角瓶 与500ml烧杯、酒精灯、枪形镊子； 烧杯、酒精灯、枪形镊子； 烧杯 按照培养基要求准备药瓶、材料表面消毒剂： 按照培养基要求准备药瓶、材料表面消毒剂：70%乙醇 乙醇 和0·1%HgCl2、无菌水； 、无菌水； 小麦未成熟或成熟种子
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植物愈伤组织培养是植物生物技术的最基本的内容， 植物愈伤组织培养是植物生物技术的最基本的内容，无 论是细胞培养，原生质体培养，植物培养和器官培养， 论是细胞培养，原生质体培养，植物培养和器官培养，一般 都要经过愈伤组织培养这个过程。因此， 都要经过愈伤组织培养这个过程。因此，愈伤组织在离体培 养过程中占有重要的地位，其用途也十分广泛， 养过程中占有重要的地位，其用途也十分广泛，最直接和最 重要的用途包括：1·无性繁殖并不大量扩繁被拍样的植 重要的用途包括： 无性繁殖并不大量扩繁被拍样的植 为细胞悬浮培养和此生代谢产物生产和利用、 物;2·为细胞悬浮培养和此生代谢产物生产和利用、原生质体 为细胞悬浮培养和此生代谢产物生产和利用 培养和细胞融合提供易于操作的起始材料； 为植物体细胞无 培养和细胞融合提供易于操作的起始材料；3·为植物体细胞无 性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础； 为外源 性系变异、细胞突变体筛选创造适宜的体系和基础；4·为外源 基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象； 为种质资 基因的遗传转化提供便于保存和利用的操作对象；5·为种质资 源的保存提供新的形式；6·为离体研究植物组织和细胞分裂、 源的保存提供新的形式； 为离体研究植物组织和细胞分裂、 为离体研究植物组织和细胞分裂 分化、带鞋和状态的转变创造适宜的材料和体系。 分化、带鞋和状态的转变创造适宜的材料和体系。 植物再生： 植物再生：植物体因受伤或生理上分离而失掉组织或器 官后，恢复或复制失去部分的现象。 官后，恢复或复制失去部分的现象。再生现象广泛存于植物 植物的组织，甚至单个细胞都具有再生能力。 中。植物的组织，甚至单个细胞都具有再生能力。在植物组 织中，尤以分生组织的再生能力更为明显。 织中，尤以分生组织的再生能力更为明显。
2·小麦成熟胚愈伤组织诱导与培养
在超净工作台上， 在超净工作台上，用灭菌的胚钩在灭菌的培养皿内将胚取 如果很难取出幼胚，可以在放大镜下操作）， ），然后用无菌 出（如果很难取出幼胚，可以在放大镜下操作），然后用无菌 镊子将其置于灭菌的诱导愈伤组织固体培养基上（含有2,2镊子将其置于灭菌的诱导愈伤组织固体培养基上（含有 Dmg/L和KT0·5mg/L，蔗糖浓度为 ，pH为5·8）。 和 ，蔗糖浓度为3%， 为 ）。 将培养瓶用封口纸包好，放在25。 的培养室内培养 的培养室内培养。 将培养瓶用封口纸包好，放在 。c的培养室内培养。一 般笑暗培养5~7天，然后再正常光照下诱导培养。光照与正常 般笑暗培养 天 然后再正常光照下诱导培养。 组织培养要求的光照想通，光照长度8~10h/d。 组织培养要求的光照想通，光照长度 。 接种后，如果发现有芽形成， 接种后，如果发现有芽形成，可以在超净工作台上用灭菌 见到将芽去掉后，再将胚接种于诱导愈伤组织培养基上， 见到将芽去掉后，再将胚接种于诱导愈伤组织培养基上，继续 进行诱导培养。 进行诱导培养。 在愈伤组织诱导培养的过程中， 在愈伤组织诱导培养的过程中，要及时对愈伤组织进行继 代培养。 代培养。 将一部分愈伤组织转移到配制好的分化培养基上或继续在 原来诱导愈伤组织培养基上，诱导植物再生。 原来诱导愈伤组织培养基上，诱导植物再生。
二、植物概述
小麦：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果， 小麦：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果， 在种子学上则称为种子，通常称为小麦。 在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白 之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。 之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境 影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有 影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色； 白色、乳白色或黄白色之分。 白色、乳白色或黄白色之分。 愈伤组织：在自然界中经常看见一些植物， 愈伤组织：在自然界中经常看见一些植物，尤其是树干的 树干，收到机械创伤后由其韧皮部附近的细胞分裂形成的 树干， 突起的“ 就是愈伤组织。 突起的“疤”，“瘤”就是愈伤组织。 胚状体：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中， 胚状体：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一 个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子 个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程， 胚相类似的结构。可进一步发育成植株。 胚相类似的结构。可进一步发育成植株。
1·小麦未成熟胚愈伤组织诱导与培养
在超净工作台上， 在超净工作台上，用灭菌的胚钩在灭菌的培养皿内将胚取 如果很难取出幼胚，可以在放大镜下操作）， ），然后用无 出（如果很难取出幼胚，可以在放大镜下操作），然后用无 菌镊子将其置于灭菌的诱导愈伤组织固体培养基上（含有2,2菌镊子将其置于灭菌的诱导愈伤组织固体培养基上（含有 Dmg/L和KT0·5mg/L，蔗糖浓度为 ，pH为5·8）。 和 ，蔗糖浓度为3%， 为 ）。 将培养瓶用封口纸包好，放在25。 的培养室内培养 的培养室内培养。 将培养瓶用封口纸包好，放在 。c的培养室内培养。一 般笑暗培养5~7天，然后再正常光照下诱导培养。光照与正常 般笑暗培养 天 然后再正常光照下诱导培养。 组织培养要求的光照想通，光照长度8~10h/d。 组织培养要求的光照想通，光照长度 。 接种后，如果发现有芽形成， 接种后，如果发现有芽形成，可以在超净工作台上用灭 菌见到将芽去掉后，再将胚接种于诱导愈伤组织培养基上， 菌见到将芽去掉后，再将胚接种于诱导愈伤组织培养基上， 继续进行诱导培养。 继续进行诱导培养。 在愈伤组织诱导培养的过程中， 在愈伤组织诱导培养的过程中，要及时对愈伤组织进行 继代培养。 继代培养。 将一部分愈伤组织转移到配制好的分化培养基上或继续 在原来诱导愈伤组织培养基上，诱导植物再生。 在原来诱导愈伤组织培养基上，诱导植物再生。
小麦愈伤组织诱导与其再生培 养体系的建立
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一、目的及意义
我国小麦目前的状况有以下几点： 我国是农业大国， 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国， 小麦面积4亿亩 产量9000万吨左右，分别占世界总量的 亿亩、 万吨左右， 小麦面积 亿亩、产量 万吨左右 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布 和 ，均居世界第一位。 在东北、西北及华北北部。 在东北、西北及华北北部。 据中国粮油信息中心的数据 显示， 市场年度（ 月至次年 月至次年6月 显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年 月）春小麦 市场年度 播种面积仅为190万公顷，较上年度减少 ％，这是多年 万公顷， ％，这是多年 播种面积仅为 万公顷 较上年度减少5％， 来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计 万公顷； 来中国春小麦种植面积首次低于 万公顷 预计03/04 年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降 万吨， 年度下降7.48%。我 年度春小麦产量为 万吨 年度下降 。 国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。 国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由 于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦， 于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的 产量的质量都不是很好，种植面积又在减少， 产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要 是能在农业上找到提高小麦的产量和质量的方法。 是能在农业上找到提高小麦的产量和质量的方法。
3·4 实验基本流程
愈伤组织的灭菌处理 取胚置于灭菌的诱导愈伤组织 固体培养基上
密封诱导培养（如有芽生长， 密封诱导培养（如有芽生长， 除去芽后继续将愈伤组织培养） 除去芽后继续将愈伤组织培养）
诱导植物再生
春小麦胚性和非胚性愈伤组织的特点
项目 颜色 表面 质地 胚性细胞的多少 胚性愈伤组织 淡黄 光滑 坚硬但易碎 大量 非胚性遇上组织 白色 粗糙 松散，水渍状 极少或无
细胞形态 细胞质 细胞核和核仁
小，圆球状 浓厚，染色深 核明显且大，核仁大
管状或不规则形状 稀薄，染色浅 核小，核仁小，或无核
3·3 小麦愈伤组织诱导与培养
2、 小麦成熟胚愈伤组织
取小麦成熟种子，用自来水清洗干净后放在 烧杯中， 取小麦成熟种子，用自来水清洗干净后放在50ml烧杯中， 烧杯中 加入温水浸泡种子，并将烧杯置于25 加入温水浸泡种子，并将烧杯置于 。c~28。c的恒温培养箱 中12~16h。然后取出用干净温水冲洗 。然后取出用干净温水冲洗3~5次，在超净工作 次 台上用70%乙醇浸泡 乙醇浸泡30s，弃掉 乙醇， 台上用 乙醇浸泡 ，弃掉70%乙醇，用无菌水冲洗 乙醇 用无菌水冲洗3 再用0·1%HgCl2灭菌 分钟，弃0·1%HgCl2，用无菌水 灭菌8分钟 分钟， 次，再用 ， 反复冲洗5~6次后备用。 次后备用。 反复冲洗 次后备用