小肠结肠炎耶尔森氏菌

食品卫生微生物学检验

小肠结肠炎耶尔森氏菌检验

1 范围

本标准规定了食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的检验方法。

本标准适用于食品和食源性疾病样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB／T 4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验

3设备和材料

除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

3.1 冰箱：2℃～5℃。

3.2 恒温培养箱：26℃±l℃、36℃±l℃。

3.3 显微镜：l0×～l00×。

3.4 均质器或灭菌乳钵。

3.5 天平：感量0.1g。

3.6 灭菌试管：16 mm×160 mm、15 mm×100 mm。

3.7 灭菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)。

3.8 灭菌锥形瓶：200 mL、500 mL。

3.9 灭菌培养皿：直径90 mm。

3.10全自动细菌生化鉴定仪，如VITEK。

4培养基和试剂

4.1 改良磷酸盐缓冲液：见第A.1章。

4.2 CIN-1培养基：见第A.2章。

4.3 改良Y培养基：见第A.3章。

4.4 改良克氏双糖培养基：见第A.4章。

4.5 糖发酵管：见第A.5章。

4.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基：见第A.6章。

4.7 半固体琼脂：见第A.7章。

4.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V—P试验用]：见第A.8章。

4.9 碱处理液：见第A.9章。

4.10 尿素培养基：见第A.10章。

4.11 API 20E生化鉴定试剂盒或VITEK GNI+生化鉴定卡。

5 检验程序

小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。

图1 小肠结肠炎耶尔森氏茵检验程序

6 操作步骤

6.1 增菌

以无菌操作称取25g(或25 mL)样品放入含有225 mL改良磷酸盐缓冲液的无菌均质杯或均质袋中，以8 000 r／min均质l min或拍击式均质器均质1 min。液体样品或粉末状样品，应振荡混匀。于26℃±l℃增菌48 h～72 h。

6.2 碱处理

除乳及其制品外，其他食品的增菌液0.5 mL与碱处理液4.5 mL充分混合l5s。

6.3 分离

将乳及其制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种CIN-1琼脂平板和改良Y 琼脂平板，于26℃±l℃培养48 h±2 h，典型菌落在CIN-1琼脂平板上为红色牛眼状菌落，在改良Y琼脂平板上为无色透明、不粘稠的菌落。

6.4 改良克氏双糖试验

分别挑取上述可疑菌落3个～5个，接种改良克氏双糖斜面，于26℃±l℃培养24 h，将斜面和底部皆变黄不产气者做进一步的生化鉴定。

6.5 尿素酶试验和动力观察

将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上，注意接种量要大，挑取一接种环，振摇几秒钟，于26℃土l℃培养2 h～4 h，然后将阳性者接种两管半固体，分别于26℃±l℃和36℃±l℃恒温培养箱中培养24 h。将26℃有动力的可疑菌落接种营养琼脂平板，进行革兰氏染色和生化试验。

6.6 革兰氏染色镜检

小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌，有时呈椭圆或杆状，大小为(0.8µm～3.0 µm)×0.8µm。

6.7 生化鉴定

6.7.1 常规生化鉴定：从营养琼脂平板上挑取单个菌落做生化试验，所有的生化反应皆在26℃±l℃培养。小肠结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特性以及与其他菌的区别见表1。

表1 小肠结肠炎耶尔森氏茵与其他相似茵的生化性状鉴别表

6.7.2生化鉴定系统

可选择使用两种生化鉴定系统(APl 20E或VITEK GNI+)中任一种，代替常规的生化鉴定。

6.7.2.1 API 20E：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照API 20E操作手册进行并判读结果。

6.7.2.2 VITEK全自动细菌生化分析仪：从营养琼脂平板上挑取单个菌落，按照VITEK GNI+

操作手册进行并判定结果。

6.8血清型鉴定

除进行生化鉴定外，可选择做血清型鉴定。具体操作方法按GB／T 4789.4中沙门氏菌0因子血清分型。

7 结果报告

综合以上生化特性报告结果，报告25g(或25 mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。

附录 A

(规范性附录)

培养基和试剂

A.1 改良磷酸盐缓冲液

A.1.1 成分

磷酸氢二钠8.23g

磷酸二氢钠 1.2g

氯化钠 5.0g

三号胆盐 1.5g

山梨醇20g

A.1.2 制法

将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加入三号胆盐及山梨醇，溶解后校正pH为7.6，分装试管，于121℃高压灭菌15 min，备用。

A.2 CIN-1培养基

A.2.1 基础培养基：

胰胨20.0g

酵母浸膏 2.0g

甘露醇20.0g

氯化钠 1.0g

去氧胆酸钠 2.0g

硫酸镁0.01g

琼脂l2.0g

蒸馏水950 mL

pH7.5±0.1

将基础培养基于121℃高压灭菌15 min，备用。

A.2.2 Irgasan：以95％的乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成0.4％的溶液，待基础培养基冷至80℃时，加入1 mL混匀。

A.2.3 冷至50℃时，加入：

中性红(3 mg／mL) 10.0 mL

结晶紫(0.1 mg／mL) 10.0 mL

头孢菌素(1.5 mg／mL) 10.0 mL

新生霉素(0.25 mg／mL) 10.0 mL

最后不断搅拌加入l0.0 mL的10％氯化锶，倾注平皿。

A.3 改良Y培养基

A.3.1 成分

蛋白胨15.0g

氯化钠 5.0g

乳糖l0.0g

草酸钠 2.0g

去氧胆酸钠 6.0g