小肠结肠炎耶尔森氏菌检验(食品微生物学检验)
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GB 4789.8—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
1 范围
本 标 准 规 定 了 食 品 中 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 (Yersiniaenterocolitica)的 检 验 方 法 。 本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。
2 设备和材料
3 培养Βιβλιοθήκη Baidu和试剂
3.1 改良磷酸盐缓冲液:见 A.1。 3.2 CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar):见 A.2。 3.3 改良 Y 培养基(AgarY,Modified):见 A.3。 3.4 改良克氏双糖培养基:见 A.4。 3.5 糖发酵管:见 A.5。 3.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见 A.6。 3.7 半固体琼脂:见 A.7。 3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和 V-P 试验用]:见 A.8。 3.9 碱处理液:见 A.9。 3.10 尿素培养基:见 A.10。 3.11 营养琼脂:见 A.11。 3.12 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。
用 接 种 环 挑 取 一 满 环 5.4 得 到 的 可 疑 培 养 物 ,接 种 到 尿 素 培 养 基 中 ,接 种 量 应 足 够 大 ,振 摇 几 秒 钟 , 26 ℃±1 ℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26 ℃±1 ℃和 36 ℃±1 ℃培养24h。将在26 ℃有动力而36 ℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行 纯 化 培 养 ,用 纯 化 物 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检 和 生 化 试 验 。
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尿素酶
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V-P 试验(26 ℃)
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鸟氨酸脱羧酶
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蔗糖
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棉子糖
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山梨醇
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甘露醇
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鼠李糖
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注 :+ 阳 性 ;- 阴 性 ;d 有 不 同 生 化 型 。
鼠疫耶 尔森氏菌 Yersinia
pestis d + +
5.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆 菌 菌 落 作 为 可 疑 菌 落 ,从 5.5 所 接 种 的 营 养 琼 脂 平 板 上 挑 取 单 菌 落 ,使 用 微 生 物 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 微 生
5.6 革兰氏染色镜检 将 纯 化 的 可 疑 菌 进 行 革 兰 染 色 。 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 呈 革 兰 氏 阴 性 球 杆 菌 ,有 时 呈 椭 圆 或 杆 状 ,
大 小 为 (0.8μm~3.0μm)×0.8μm 5.7 生化鉴定 5.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26 ℃±1 ℃进行。小肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 的 主 要 生 化 特 征 以 及 与 其 他 相 似 菌 的 区 别 见 表 1。
除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外 ,其 他 设 备 和 材 料 如 下 : 2.1 冰箱:0 ℃~4 ℃。 2.2 恒温培养箱:26 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃。 2.3 显微镜:10倍~100倍。 2.4 均质器。 2.5 天平:感量0.1g。 2.6 灭菌试管:16 mm×160 mm、15 mm×100 mm。 2.7 灭菌吸管:1 mL (具0.01 mL 刻度)、10 mL (具0.1 mL 刻度)。 2.8 锥形瓶:200 mL、500 mL。 2.9 灭菌平皿:直径90 mm。 2.10 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。
1
4 检验程序 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 检 验 程 序 见 图 1。
GB 4789.8—2016
图1 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌 以无菌操作取25g(或25 mL)样品放入含有225 mL 改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均
质袋内,以8000r/min均质1 min或拍击式均质器均质1 min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。 均质后于26 ℃±1 ℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。 5.2 碱处理
3
GB 4789.8—2016 物生化鉴定系统进行鉴定。 5.8 血清型鉴定(选做项目)
除进行生化鉴定外,可选择做血清 型 鉴 定。在 洁 净 的 载 玻 片 上 加 一 滴 O 因 子 血 清,将 待 试 培 养 物 混入其内,使成为均一性 混 浊 悬 液,将 玻 片 轻 轻 摇 动 0.5 min~1 min,在 黑 色 背 景 下 观 察 反 应。 如 在 2 min 内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以 检查有无自凝现象;具体操作方法可按 GB4789.4中沙门氏菌 O 因子血清分型方法进行。 6 结果与报告
5.4 改良克氏双糖试验
分 别 挑 取 5.3 中 的 可 疑 菌 落 3 个 ~5 个 ,分 别 接 种 于 改 良 克 氏 双 糖 铁 琼 脂 ,接 种 时 先 在 斜 面 划 线 ,再 于底层穿刺,26 ℃±1 ℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。
5.5 尿素酶试验和动力观察
表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表
项目 动力(26 ℃)
小肠结肠炎 中间型耶
弗氏耶
克氏耶
假结核耶
耶尔森氏菌 尔森氏菌
尔森氏菌
尔森氏菌
尔森氏菌
Yersinia
Yersinia
Yersinia
Yersinia
Yersinia
enterocolitica intermedia frederiksenii kirstensenii pseudotuberculosis
除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5 mL 与碱处理液4.5 mL 充分混合15s。
2
GB 4789.8—2016
5.3 分离
将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其 他 食 品 增 菌 液 分 别 接 种 于 CIN-1 琼 脂 平 板 和 改 良 Y 琼 脂 平板,26 ℃±1 ℃培养48h±2h。典型菌落在 CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛 眼状菌落),菌落大小为1 mm~2 mm,在改良 Y 琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
1 范围
本 标 准 规 定 了 食 品 中 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 (Yersiniaenterocolitica)的 检 验 方 法 。 本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。
2 设备和材料
3 培养Βιβλιοθήκη Baidu和试剂
3.1 改良磷酸盐缓冲液:见 A.1。 3.2 CIN-1培养基(CepulodinIrgasanNovobiocinAgar):见 A.2。 3.3 改良 Y 培养基(AgarY,Modified):见 A.3。 3.4 改良克氏双糖培养基:见 A.4。 3.5 糖发酵管:见 A.5。 3.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见 A.6。 3.7 半固体琼脂:见 A.7。 3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和 V-P 试验用]:见 A.8。 3.9 碱处理液:见 A.9。 3.10 尿素培养基:见 A.10。 3.11 营养琼脂:见 A.11。 3.12 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。
用 接 种 环 挑 取 一 满 环 5.4 得 到 的 可 疑 培 养 物 ,接 种 到 尿 素 培 养 基 中 ,接 种 量 应 足 够 大 ,振 摇 几 秒 钟 , 26 ℃±1 ℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26 ℃±1 ℃和 36 ℃±1 ℃培养24h。将在26 ℃有动力而36 ℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行 纯 化 培 养 ,用 纯 化 物 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检 和 生 化 试 验 。
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蔗糖
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棉子糖
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注 :+ 阳 性 ;- 阴 性 ;d 有 不 同 生 化 型 。
鼠疫耶 尔森氏菌 Yersinia
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5.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆 菌 菌 落 作 为 可 疑 菌 落 ,从 5.5 所 接 种 的 营 养 琼 脂 平 板 上 挑 取 单 菌 落 ,使 用 微 生 物 生 化 鉴 定 试 剂 盒 或 微 生
5.6 革兰氏染色镜检 将 纯 化 的 可 疑 菌 进 行 革 兰 染 色 。 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 呈 革 兰 氏 阴 性 球 杆 菌 ,有 时 呈 椭 圆 或 杆 状 ,
大 小 为 (0.8μm~3.0μm)×0.8μm 5.7 生化鉴定 5.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26 ℃±1 ℃进行。小肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 的 主 要 生 化 特 征 以 及 与 其 他 相 似 菌 的 区 别 见 表 1。
除 微 生 物 实 验 室 常 规 灭 菌 及 培 养 设 备 外 ,其 他 设 备 和 材 料 如 下 : 2.1 冰箱:0 ℃~4 ℃。 2.2 恒温培养箱:26 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃。 2.3 显微镜:10倍~100倍。 2.4 均质器。 2.5 天平:感量0.1g。 2.6 灭菌试管:16 mm×160 mm、15 mm×100 mm。 2.7 灭菌吸管:1 mL (具0.01 mL 刻度)、10 mL (具0.1 mL 刻度)。 2.8 锥形瓶:200 mL、500 mL。 2.9 灭菌平皿:直径90 mm。 2.10 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。
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4 检验程序 小 肠 结 肠 炎 耶 尔 森 氏 菌 检 验 程 序 见 图 1。
GB 4789.8—2016
图1 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌 以无菌操作取25g(或25 mL)样品放入含有225 mL 改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均
质袋内,以8000r/min均质1 min或拍击式均质器均质1 min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。 均质后于26 ℃±1 ℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。 5.2 碱处理
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GB 4789.8—2016 物生化鉴定系统进行鉴定。 5.8 血清型鉴定(选做项目)
除进行生化鉴定外,可选择做血清 型 鉴 定。在 洁 净 的 载 玻 片 上 加 一 滴 O 因 子 血 清,将 待 试 培 养 物 混入其内,使成为均一性 混 浊 悬 液,将 玻 片 轻 轻 摇 动 0.5 min~1 min,在 黑 色 背 景 下 观 察 反 应。 如 在 2 min 内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以 检查有无自凝现象;具体操作方法可按 GB4789.4中沙门氏菌 O 因子血清分型方法进行。 6 结果与报告
5.4 改良克氏双糖试验
分 别 挑 取 5.3 中 的 可 疑 菌 落 3 个 ~5 个 ,分 别 接 种 于 改 良 克 氏 双 糖 铁 琼 脂 ,接 种 时 先 在 斜 面 划 线 ,再 于底层穿刺,26 ℃±1 ℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。
5.5 尿素酶试验和动力观察
表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表
项目 动力(26 ℃)
小肠结肠炎 中间型耶
弗氏耶
克氏耶
假结核耶
耶尔森氏菌 尔森氏菌
尔森氏菌
尔森氏菌
尔森氏菌
Yersinia
Yersinia
Yersinia
Yersinia
Yersinia
enterocolitica intermedia frederiksenii kirstensenii pseudotuberculosis
除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5 mL 与碱处理液4.5 mL 充分混合15s。
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GB 4789.8—2016
5.3 分离
将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其 他 食 品 增 菌 液 分 别 接 种 于 CIN-1 琼 脂 平 板 和 改 良 Y 琼 脂 平板,26 ℃±1 ℃培养48h±2h。典型菌落在 CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛 眼状菌落),菌落大小为1 mm~2 mm,在改良 Y 琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。