酶与蛋白质工程第1章蛋白质与蛋白质工程讲述
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此两相邻的肽键平面可 Ca
以作相对旋转
肽平面
一个具有生物活性的蛋白质多肽链在一定条件下往往只有一种 或很少的几种构象。主要是因为肽链结构的高度共振稳定性
蛋白质结构
蛋白质的一级结构
一级结构（primary structure）：即蛋白质的化学结构，是指多肽链 上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，也包括二硫键的数目
➢ 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋 势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既 不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基 酸的等电点
➢ 氨基酸在等电点时的特点：
1. 净电荷数等于零，在电场中不移动； 2. 此时氨基酸的溶解度最小
蛋白质的化学结构和高级结构
肽键（peptide bond）和肽（peptide ）
R CH COOH NH3+
+OH-
+H+
(pK´1)
pH<pI
R CH COONH3+
pH=pI
+OH- R CH COO-
+H+
(pK´2)
NH2
pH>pI
带电荷为正
带电荷为零
带电荷为负
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度
▪ 等电点 (isoelectric point, pI)
含芳香基团
含碱性侧链基团（带正电荷）
Phe, F; Tyr, Y; Trp, W
Lys, K; Arg, R; His, H
含酸性侧链基团（带负电荷） Asp, D; Glu, E
氨基酸的两性解离
氨基酸分子在水溶液中呈两性离子状态，在其 等电点时，氨基酸所带的正、负电荷相等，净 电荷为零。
氨基酸的两性解离及等电点
5
10
15
20
25
30
牛胰岛素的一级结构： 51个氨基酸，A（21肽）、B（30肽）两条肽 链，A链内一对S-S，A和B链间2对S-S
蛋白质顺序测 定 基本战略
纯蛋白质 拆开二硫键
末端氨基酸测定 专一性裂解 将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
一级结构测定的基本流程:
(1) 拆分蛋白质分子的多肽链; (2) 鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基; (3) 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较
肽键的结构特点
氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽 键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转
O — C — NH —
O–
+
— C NH —
O Ca — C
键长介于单 双键之间
N — Ca
H
肽平面/酰胺平面
肽平面 —由肽键周围的6个原子组成的刚性平面
由于α-碳原子与其他原
子之间均形成单键，因
S
S
A
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
5
10
15
ຫໍສະໝຸດ Baidu
S
21 S
B
S
S
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
小的片段; (4) 测定各肽段的氨基酸序列; (5) 重建完整多肽链的一级结构; (6) 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置
① 拆分非共价键：可用8mol/L尿素 或6mol/L盐酸胍处理
② 拆分二硫键：几条多肽链通过二
硫键交联在一起。可在8mol/L尿素
或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的
拆分
由于其连续反应特性， 成为蛋白质序列分析仪 的分析原理！
C末端分析方法
肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上 解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与 苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
蛋白质的基本结构单位—氨基酸
氨基酸的基本结构和构型
存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质经强酸水解之后 可以得到20种氨基酸，并且均为L-氨基酸（除了甘氨酸），含不对 称的α-碳原子。它们之间的差别在于有不同的侧链基团 R
COO-
COOH
+α
H3N C H
或
α
H2N C H
R
R
氨基酸结构通式
第一讲 蛋白质与蛋白质工程
蛋白质在生命活动中的重要作用
蛋白质在机体内的生物学功能
生物催化作用：酶 运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白 调节作用：如胰岛素、生长激素 运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白 防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子 营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白 结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白 能量转换蛋白：如细胞色素 基因调节蛋白：如阻遏蛋白
肽键：指蛋白质分子中，由一个氨基酸的α-COOH和另一个氨基酸的αNH2之间脱水缩合而成的酰胺键，它是蛋白质结构中的主要共价键
肽：由肽键形成的化合物（二肽、三肽、寡肽、多肽）
O
NH2-CH-C +
H OH
甘氨酸
O NH-CH-C
H H OH
甘氨酸
-HOH
O
O
NH2-CH-C-N-CH-C
H H H OH
-巯基乙醇处理，使二硫键还原为
巯基
N-末端和C-末端氨基酸残基的确定— 为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点
N端分析方法： ① 二硝基氟苯法 (DNFB法)
② 丹磺酰氯法 (DNS法)
丹磺酰-氨 基酸有很强 的荧光性质
③ 苯异硫氰酸(酯)法 (PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 )
肽键
多肽（polypeptide）和多肽链（polypeptide chain）
（N-端）
（C-端）
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为 氨基酸序列，多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基(amino acid residue)
上图为： 丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-异亮氨酸
CHRH3
COOC +NH3
H
L-氨基酸的通丙甘式氨氨酸酸
除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性
含非极性侧链基团
含极性侧链基团
Gly, G Ala, A Val, V Leu, L Met, M Ile, I
Ser, S Thr, T Cys, C Pro, P Asn, N Gln, Q
N-端 氨 基 酸
C- 端 氨 基 酸
H+
RO
Rn O
NH2NH2H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH
以作相对旋转
肽平面
一个具有生物活性的蛋白质多肽链在一定条件下往往只有一种 或很少的几种构象。主要是因为肽链结构的高度共振稳定性
蛋白质结构
蛋白质的一级结构
一级结构（primary structure）：即蛋白质的化学结构，是指多肽链 上各种氨基酸残基的种类和排列顺序，也包括二硫键的数目
➢ 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋 势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，在电场中既 不向阳极也不向阴极移动。此时溶液的pH值称为该氨基 酸的等电点
➢ 氨基酸在等电点时的特点：
1. 净电荷数等于零，在电场中不移动； 2. 此时氨基酸的溶解度最小
蛋白质的化学结构和高级结构
肽键（peptide bond）和肽（peptide ）
R CH COOH NH3+
+OH-
+H+
(pK´1)
pH<pI
R CH COONH3+
pH=pI
+OH- R CH COO-
+H+
(pK´2)
NH2
pH>pI
带电荷为正
带电荷为零
带电荷为负
氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度
▪ 等电点 (isoelectric point, pI)
含芳香基团
含碱性侧链基团（带正电荷）
Phe, F; Tyr, Y; Trp, W
Lys, K; Arg, R; His, H
含酸性侧链基团（带负电荷） Asp, D; Glu, E
氨基酸的两性解离
氨基酸分子在水溶液中呈两性离子状态，在其 等电点时，氨基酸所带的正、负电荷相等，净 电荷为零。
氨基酸的两性解离及等电点
5
10
15
20
25
30
牛胰岛素的一级结构： 51个氨基酸，A（21肽）、B（30肽）两条肽 链，A链内一对S-S，A和B链间2对S-S
蛋白质顺序测 定 基本战略
纯蛋白质 拆开二硫键
末端氨基酸测定 专一性裂解 将肽段分离并测出顺序
将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
一级结构测定的基本流程:
(1) 拆分蛋白质分子的多肽链; (2) 鉴定多肽链的N一末端和C一末端残基; (3) 用两种或几种不同的断裂方法将多肽链裂解成较
肽键的结构特点
氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用，肽 键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转
O — C — NH —
O–
+
— C NH —
O Ca — C
键长介于单 双键之间
N — Ca
H
肽平面/酰胺平面
肽平面 —由肽键周围的6个原子组成的刚性平面
由于α-碳原子与其他原
子之间均形成单键，因
S
S
A
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
5
10
15
ຫໍສະໝຸດ Baidu
S
21 S
B
S
S
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
小的片段; (4) 测定各肽段的氨基酸序列; (5) 重建完整多肽链的一级结构; (6) 确定半胱氨酸残基间形成的二硫键的位置
① 拆分非共价键：可用8mol/L尿素 或6mol/L盐酸胍处理
② 拆分二硫键：几条多肽链通过二
硫键交联在一起。可在8mol/L尿素
或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的
拆分
由于其连续反应特性， 成为蛋白质序列分析仪 的分析原理！
C末端分析方法
肼解法：多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上 解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与 苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离
RO H2N CH C
R n-1O
Rn O
HN CH C HN CH C OH
蛋白质的基本结构单位—氨基酸
氨基酸的基本结构和构型
存在于自然界的氨基酸有300种。动物机体的蛋白质经强酸水解之后 可以得到20种氨基酸，并且均为L-氨基酸（除了甘氨酸），含不对 称的α-碳原子。它们之间的差别在于有不同的侧链基团 R
COO-
COOH
+α
H3N C H
或
α
H2N C H
R
R
氨基酸结构通式
第一讲 蛋白质与蛋白质工程
蛋白质在生命活动中的重要作用
蛋白质在机体内的生物学功能
生物催化作用：酶 运输作用：如血红蛋白、转铁蛋白 调节作用：如胰岛素、生长激素 运动作用：如肌动蛋白和肌球蛋白 防御功能：如免疫球蛋白、凝血因子 营养功能：如卵清蛋白、酪蛋白 结构蛋白：如胶原蛋白、角蛋白 能量转换蛋白：如细胞色素 基因调节蛋白：如阻遏蛋白
肽键：指蛋白质分子中，由一个氨基酸的α-COOH和另一个氨基酸的αNH2之间脱水缩合而成的酰胺键，它是蛋白质结构中的主要共价键
肽：由肽键形成的化合物（二肽、三肽、寡肽、多肽）
O
NH2-CH-C +
H OH
甘氨酸
O NH-CH-C
H H OH
甘氨酸
-HOH
O
O
NH2-CH-C-N-CH-C
H H H OH
-巯基乙醇处理，使二硫键还原为
巯基
N-末端和C-末端氨基酸残基的确定— 为氨基酸序列排列建立两个重要的参考点
N端分析方法： ① 二硝基氟苯法 (DNFB法)
② 丹磺酰氯法 (DNS法)
丹磺酰-氨 基酸有很强 的荧光性质
③ 苯异硫氰酸(酯)法 (PITC法、PTC法、PTH法、Edman降解法 )
肽键
多肽（polypeptide）和多肽链（polypeptide chain）
（N-端）
（C-端）
在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为 氨基酸序列，多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基(amino acid residue)
上图为： 丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-异亮氨酸
CHRH3
COOC +NH3
H
L-氨基酸的通丙甘式氨氨酸酸
除了甘氨酸外，其他均具有不对称碳原子，具有旋光性
含非极性侧链基团
含极性侧链基团
Gly, G Ala, A Val, V Leu, L Met, M Ile, I
Ser, S Thr, T Cys, C Pro, P Asn, N Gln, Q
N-端 氨 基 酸
C- 端 氨 基 酸
H+
RO
Rn O
NH2NH2H2N CH C NHNH2 +H2N CH C OH