乙醇脱氢酶基因的克隆及转接

题目乙醇脱氢酶基因的克隆及转接___________姓名___邹昊天________________________________ 学号___60____________________________

专业___应用生物科学__________________________ 年级___大三__________________________________

乙醇脱氢酶基因的克隆及转接

一、实验背景介绍

醋酸杆菌在工业生产和日常生活中，都是极为常见而重要的菌种，参与食醋酿造和维生素C制造。在醋酸杆菌氧化乙醇产生乙酸的生化过程中，乙醇脱氢酶是参与发酵的一种重要酶，其他酶种还包括乙醛脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等。乙醇脱氢酶分布在醋酸杆菌细胞膜和细胞质中，但膜蛋白较细胞质酶活性大得多。对于醋酸杆菌来说，细胞膜侧乙醇脱氢酶最佳pH为4。

乙醇脱氢酶在生物中广泛存在，包括微生物、植物、哺乳动物等，但微生物，尤其是醋酸杆菌，胞内具有丰富的乙醇脱氢酶酶系，是克隆乙醇脱氢酶基因的好材料。

在巴氏醋酸杆菌中，乙醇脱氢酶以两个亚基adh1和adh2组成，因此需要克隆两个基因，自组装后获得有活性的乙醇脱氢酶。

二、实验目的与意义

本实验的目的是克隆巴氏醋酸杆菌AC2005菌株中的乙醇脱氢酶基因，利用电击法将该基因导入农杆菌，筛选有乙醇脱氢酶活性的农杆菌菌株，并检测乙醇脱氢酶的活力。

本实验的意义在于克隆醋杆菌菌株中的adh1和adh2基因，由于农杆菌没有乙醇脱氢酶基因，将醋杆菌的乙醇脱氢酶基因导入农杆菌后，筛选乙醇脱氢酶活性高的农杆菌菌株，可以帮助在淹水条件下无氧呼吸产生乙醇的植株根系分解乙醇，使植株抗逆性提高。

三、材料与方法

实验材料：巴氏醋酸杆菌AC2005、农杆菌GV3101、pCAMBIA2301-ZH质粒（含Kpn I 酶、Sal I酶、BamH I酶、Hind III酶切位点）

实验试剂：PCR产物回收试剂盒、YEP固体培养基、YEP液体培养基、卡那霉素、利福平、Kpn I酶、Sal I酶、BamH I酶、Hind III酶、T4 DNA连接酶、dNTPs、FastPfu DNA 聚合酶、ddH2O、PCR Buffer、引物P1、P2、P3、P4（序列下述）、琼脂糖、EB、TBE电泳缓冲液、NaCl、TE（pH=；pH=）、苯酚、氯仿、10× Ligase Buffer、PEG 4000、IPTG、L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH=）、NAD+、乙醇、基因组DNA提取试剂盒

实验仪器：PCR仪、摇床、微量移液枪（、10uL、100uL、1000uL）、电泳池、恒温箱、紫外-可见分光光度计、冰箱、水浴锅等

实验基本流程：提取巴氏醋酸杆菌AC2005基因组DNA→PCR扩增adh1基因和adh2基因→PCR产物回收→凝胶电泳检测特异条带→双酶切PCR产物和质粒→连接质粒和基因→农杆菌活化→电击法导入活化的农杆菌，培养→检测乙醇脱氢酶活力

实验具体操作流程：

a)提取巴氏醋酸杆菌AC2005基因组DNA

1. 将5mL过夜培养的巴氏醋酸杆菌细胞转移到微量离心管中，12000r/min离心3min，收集沉淀下来的细胞。

2. 加567ul TE溶液悬浮沉淀，并加30ul 10% SDS, 3ul蛋白酶K(20mg/ml)，混匀，37℃水浴保温1小时。

3. 加100ul 的5mol/L NaCl，混匀。

4. 加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴保温10min。

5. 用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。

6. 仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min, 即出现絮状DNA沉淀。

7. 用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20℃。

b)PCR扩增adh1基因和adh2基因

①乙醇脱氢酶adh1的克隆

引物P1为5'-CGGGGTACCATGACCCGCCCCGCCTCCGCCAAGA-3'，下划线为Kpn I 酶切位点，引物P2为5'-ACGCGTCGACTTAGGGGTTAATGCCAAGTGTCG-3'，下划线为Sal I酶切位点。

PCR反应体系：DNA模板2μL；P1（20μmol/L）μL；P2（20μmol/L）μL；dNTPs（L each）5μL；5×Buffer 10μL；FastPfu DNA聚合酶（μL）μL；ddH2O补足至50μL。反应条件：95℃变性5min；（95℃变性50s+50℃退火30s+72℃延伸150s）*30个循环；72℃延伸10min。得到PCR产物，4℃保存。

②乙醇脱氢酶adh2的克隆

引物P3为5'-CGGGA TCCGA TGA TGA TGAACAGGCTAAAAACTGC-3'，下划线为Bam H I酶切位点，引物P4为5'-CCCAAGCTTTTACTGGGCTTCATCCACACCAGCA-3'，下划线为Hind III酶切位点。

PCR反应体系：DNA模板2μL；P3（20μmol/L）μL；P4（20μmol/L）μL；dNTPs（L each）5μL；5×Buffer 10μL；FastPfu DNA聚合酶（μL）μL；ddH2O补足至50μL。反应条件：96℃变性5min；（96℃变性50s+55℃退火30s+72℃延伸80s）*3个循环；（96℃变性50s+57℃退火30s+72℃延伸80s）*4个循环；（96℃变性50s+59℃退火30s+72℃延伸80s）*22个循环；72℃延伸10min。得到PCR产物，4℃保存。

c)PCR产物回收

①在PCR反应液中加入100μL Buffer PCR-A，混匀，转移到DNA 制备管中，将DNA 制备管置于2 ml 离心管中，11000×g 离心2min，弃滤液。

②将制备管置回2 ml 离心管，加ml Buffer W2，11000×g 离心12min，弃滤液。注意确认在Buffer W2中加入无水乙醇。

③将制备管置于离心管中，将制备管置回2 ml 离心管，加ml Buffer W2，11000×g 离心2 min。

④将制备管置于洁净的离心管中，在DNA 制备膜正中央加30μl 65℃去离子水，室温静置1 min。11000×g 离心2 min。再加入10μl 65℃去离子水，11000×g 离心2 min，洗脱DNA。

d)凝胶电泳检测特异条带

①称取琼脂糖，加入120mL 1×TBE，在微波炉中加热3min，使琼脂糖完全溶解。

②待溶液稍冷却（手触摸不烫），加入两滴EB，混合均匀，倒在大槽凝胶板上。

③待溶液完全凝固，小心拔出梳子，取下凝胶板，去除背面多余的凝胶，将凝胶板置于电泳仪中，使电泳液完全没过凝胶。

④取4μL PCR产物，加μL Buffer，在各点样孔中加4μL混匀溶液，在最右的点样孔中加入2μL Marker。

⑤设置电压为140V，时间为30min，电流120mA。开启电泳仪。

⑥待电泳结束后，小心取出凝胶，放入紫外自显影台板中，获得条带。

e)双酶切PCR产物和质粒

在离心管中加入5μL质粒、1μL 10×Buffer、μL Kpn I、μL Sal I、μL去离子水，混匀，在37℃培养箱中酶切30min。标记为1号管。

在离心管中加入5μL PCR产物、1μL 10×Buffer、μL Kpn I、μL Sal I、μL去离子水，混匀，在37℃培养箱中酶切30min。标记为2号管。

在离心管中加入5μL质粒、1μL 10×Buffer、μL Bam H I、μL Hind III、μL去离子水，混匀，在37℃培养箱中酶切30min。标记为3号管。