免疫组化在血液肿瘤病理诊断中的应用及意义(一)

免疫组化在血液肿瘤病理诊断中的应用及意义（一）

IHC方法相对简单，但从取材到发报告之间环节较多，任何环节的疏忽都可能造成检测结果偏差，甚至导致漏诊、误诊。除IHC染色常规注意事项外，血液肿瘤标本的检测还有其特殊性。 1.标本的前期处理

血液系统疾病病理诊断标本，主要是淋巴结、脾脏和骨髓组织。与其它组织相似，造血细胞表面抗原不同其稳定性会有差异，从而对固定剂的耐受性不同。组织固定的原则，是采用10%中性福尔马林作为固定剂，固定时间最好不超过24小时。

(1)淋巴结：取材后迅速固定，待组织表面变硬即可修块。以淋巴结大小为直径，厚度不超过3mm，以使组织得到充分的固定。如淋巴结中有淤血、坏死成分，应尽量除去。组织制片中的每个步骤都应严格掌握，以免破坏组织的抗原活性。(2)脾脏：脾脏组织较大，应注意多点取材；脾脏又是贮血器官，含血量多，取材时应尽量除去积血；取材大小以2×2×7.5px 为宜，取材后尽快固定。在多块标本中，病理医师应根据HE切片，挑出病变明显的1～2 块作IHC 染色。(3)骨髓组织：特点为组织小，主要为骨质，造血细胞充斥于骨小梁之间。在组织制片的每个步骤都应相应缩短时间。骨髓组织制片需要脱钙，酸性脱钙液对抗原活性有影

响，常规采用的2%硝酸，脱钙不应超过3小时。EDTA脱钙液偏碱性，比较温和，效果较好，只是时间长，约需24～48小时。(4)骨髓涂片：某些情况下当骨髓组织取材不好，如太小或组织为骨皮质、血凝块等不能进行石蜡包埋制片时，可用骨髓涂片代替。但注意骨髓涂片不能太厚，最好不混血。涂片稍干后用甲醇：丙酮(1：1)固定90秒后染色。涂片不能在室温下久存。(5)外周血涂片：某些特殊情况不能采用穿刺骨髓取材时，可用外周血涂片代替。前提是外周血有核细胞总数必须较多，结果才相对可靠，固定同骨髓涂片。(6)组织印片：当疾病诊断和分型必需的标记物不能用于石蜡切片时，可用组织印片来补救。将新鲜软组织取材后，按取材大小平放于干净的载玻片上，轻压，然后垂直取下标本，组织表面的细胞即印在玻片上，风干，固定同骨髓涂片。组织印片与冰冻切片相似，由于形态不好，除特殊情况外，临床上尽量不用。 2.IHC所采用的检测系统IHC染色方法很多，如免疫荧光、免疫酶标、免疫金标。免疫酶标是以酶标记的抗体与组织或细胞作用后，加入酶的底物生成有色产物，通过光镜对细胞表面或细胞内抗原进行定位。免疫酶标以其标记酶不同又分为标记过氧化物酶(HRP)法，如ABC、SP及相应二步法；标记碱性磷酸酶(AP)法，如SAP及相应的二步法。葡萄糖氧化酶(GOD)分子量较大，具有较多的氨基酸，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶活

时，要兼顾到这两个方面。如T细胞淋巴瘤，选择敏感性好的CD45R0与特异性强的CD3组合。同时，由于现有检测抗体并非白血病细胞特异性试剂，而是针对不同人血细胞分化抗原的单抗，因此进行分型时，需要配套抗体联合使用、综合分析、统一判断。 4.检测结果的分析

IHC 染色理想的结果是：阳性反应部位明确、色泽鲜艳、背景清晰、对比度好。但由于诸如石蜡制片质量、不同组织内源性因素、不同厂家、不同批号抗体质量的差异、抗原修复方式等因素的影响，染色结果并不一定理想。所以病理医师在分析结果时，首先要分清阳性细胞是反应性细胞，残留细胞还是肿瘤性细胞，在确定阳性肿瘤细胞后，一般根据以下几方面综合分析，得出正确的诊断。

(1)阳性定位：

阳性细胞的定位是IHC诊断的重要依据。不同抗原阳性表达可分别定位于细胞膜、细胞质、细胞核或膜/质、核/质等不同部位，不在特定部位表达应视为阴性。(2)阳性强度和阳性率：

依据欧洲EGIL免疫分型建议，如果正常细胞成分在骨髓和外周血中只占极少部分时，具有某些分化相关抗原的髓系细胞＞20% 、淋系细胞＞30% 则考虑白血病细胞。但也不能仅依靠阳性率的高低作为分型的唯一依据。某一种标记

只要是瘤细胞，即使数量不多亦可作为分型依据。阳性强度取决于细胞中抗原含量的多少，也与肿瘤细胞分化的不一致性有关，致使阳性表达有强弱之分。(3)阳性细胞的分布：骨髓及外周血涂片、骨髓组织切片，在多数情况下，阳性标记瘤细胞呈弥漫性或散在性均匀分布，偶见小灶性分布，如转移癌、淋巴瘤累及骨髓的部分类型。故阳性结果常以计数阳性率来表示。如阳性标记细胞有形态上的异常再加以注明。而脾脏、淋巴结细胞密度大，正常情况下T、B淋巴细胞有一定的分布区域，一般B淋巴细胞占整个淋巴细胞群体的25～50%，T淋巴细胞约占50～75%。不同类型淋巴瘤细胞分布也不同，所以计数百分率不完全准确。

确定单克隆性增生：大多数情况下，T或B阳性瘤细胞占绝对优势，在正常应该分布较少的区域也广泛增生；有时T、B两系均有不同程度表达，可能是由于交叉反应或双标记所致，应选择更特异的抗体检测；个别情况下T、B标记均不满意，则以HE瘤细胞形态特点来确定类型。阳性细胞数量只是诸多判定因素之一，阳性瘤细胞的分布和形态是淋巴瘤分型的重要依据，如滤泡性淋巴瘤生发中心BcL-2阳性；弥漫大B细胞淋巴瘤肿瘤性大细胞CD20阳性及生发中心BcL-6阳性；霍奇金淋巴瘤H/RS细胞CD30阳性均具有诊断意义。(4)如何区别特异性与非特异性反应：

IHC染色结果有时并不理想。如何区别特异性与非特异

性结果，得出科学的结论呢？一般来说，特异性反应产物常分布于特定部位，多定位于单个细胞的细胞膜、细胞质或细胞核，且与阴性细胞相互交杂分布，由于细胞内含抗原量不同，表现在同一切片上出现不同强度的阳性染色结果。非特异性反应常表现为：无一定的分布规律，阳性不限于单个细胞，而在某一部位成片均匀着色；细胞和周围结缔组织无区别；组织边缘及皱折处呈现很强的染色。二、IHC在肿瘤组织细胞来源鉴别中的应用

肿瘤组织来源的鉴别仅适用于靠形态学不能确定来源的异常细胞。最常见为恶性未分化小细胞肿瘤的鉴别。

波形蛋白Vimentin在很多肿瘤中都可表达，特异性较差，必要时加做肌源性标记物如myosin、Desmin等。值得注意的是：并不是所有血液系统肿瘤LCA均为阳性。树突状细胞肉瘤、淋巴母细胞淋巴瘤常不表达；少数间变性大细胞淋巴瘤、NK/T 细胞淋巴瘤LCA 也可阴性；霍奇金淋巴瘤亦不表达。故不能因为LCA 阴性而完全排除淋巴瘤的可能。在排除了其它组织来源的基础上，可考虑增加其它抗体检测。三、IHC在血液系统良恶性疾病鉴别中的应用组织形态学诊断中最易误诊的血液系统良恶性疾病主要是淋巴组织反应性增生与恶性淋巴瘤，误诊率可高达10～30%；如淋巴滤泡反应性增生与滤泡性淋巴瘤。利用特异性单抗IHC染色，往往能达到较理想的鉴别效果。