western blot问题汇总

WesternBlot问题解答

1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。

2.条带歪斜、或漂移

因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。

另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。

3.单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。

4、转膜缓冲液过热：

缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。

5背景过高！

1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。

2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决

3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。

4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。

5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。

6、没有信号：

1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。

2)确信你的蛋白表达

3)确信蛋白高效的转移到你的膜上

4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素

5)ECL试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！

7、微量进样器堵了怎么办？

首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！

如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决：

1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来；

2）方法1不灵，若是25或50ul的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质；

3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出，

4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！

5）或者放在超声清洗仪里，超声试试

注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯

8、关于SDS蛋白电泳的一点心得

最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人在看过回帖后，结合自己的试验，重新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享：

1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。

2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用90/120，后来改用了80并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量18000 Da，15%的分离胶）；

3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染）。

9.分别用多大电流转膜?

1）一般跟你的分离胶的浓度有关。

2）与你的转印系统型号有关！

3）与目的蛋白的分子量有关1

一般50KD左右的蛋白，50mA，1.5h；

10.好几个蛋白，我做免疫荧光都做得很好，抗体说明也是可以用于western的，可是就做不出来！显影后只有很弱的非特异带。而另一个蛋白，perk却做得很好，操作都是一样的，抗体稀释也是按厂家说明的。

1)你用的是单克隆抗体吗？如果是的话，请注意western 是在蛋白质变性的条件下进行的，活性状态下可以反映的抗体在变形状态下却不一定特异性很强，可能其他的蛋白质变性之后产生了能与之反映的抗原决定簇！

另外，要做好对照！抗体是什么公司的？有的公司会将康体稀释后再卖（奸商），所以抗体的滴度，根据公司的要求也不一定准！

2)如果是单抗，western blotting电泳后蛋白变性，构象表位可能消失，仅存在线性表位，单抗可能不识别。所以WESTERN BLOTTING 做不出来了。

11.我的WESTERN为什么出现了多条带，每个加样槽中都出现了多条带，而且好象都很有规律，为什么？是封闭时间不够吗？请指教我做WESTERN 是想知道处理后细胞分泌细胞因子数量的变化，这样必须要内参吗？

可能性

1)一抗、或二抗抗体浓度太高

2)多克隆抗体本身的非特异性反应

3)抗体的特异性不强

4)蛋白异构体或降解！

5)你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。