化学发光原理

简介

上世纪70年代中期Arakawe首先报道CLIA ，发展至今已经成为一种成熟的、先进的超微量活性物质检测技术，应用范围广泛，近10年发展迅猛，是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级，可以完全替代放射免疫分析、彻底淘汰酶联免疫分析。主要具有灵敏度高、特异性强、试剂价格低廉、试剂稳定且有效期（6-18个月）、方法稳定快速、检测范围宽、操作简单自动化程度高等优点。高灵敏度的化学发光检测技术以被广大研究人员所认可，并正逐渐替代传统的生物检测技术。

化学发光与放射免疫法是公认的肿瘤标志物和各种激素最精确和最成熟的检测方法，二者的原理、技术与方法早已成熟并被国外各大医院用于肿瘤检测和激素检测，二者的试剂与仪器均通过美国FDA认证与我国药监局的批准。但是，放射免疫分析法虽有很高的灵敏度，却存在放射性防护和同位素污染的问题，况且试剂价格昂贵只有一个有保质期，在基层医疗机构难以普及。化学放光免疫分析仪继承了放射免疫的所有优点，同时克服了放射免疫和酶联免疫各自的缺点，是临床免疫检测最理想的新方法。可以肯定的说，她将取代放射免疫和酶联免疫成为临床免疫检测最理想的新技术。[1]

2原理

化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。

3类型

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

(1)化学发光标记免疫分析法;

(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法

化学发光标记免疫分析

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) , 是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而

发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法 , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。

化学发光酶免疫分析

从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,

CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。

HRP 标记的CLEIA

常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l) , 或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼) , 是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行, 在过氧化物酶及活性氧[ 过氧化阴离子(O 2- ) , 单线态氧(1O 2 ) , 羟自由基(OH·) , 过氧化氢(H2O 2) ]存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光, 其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体) , 但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体, 进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物, 在过氧化物酶和起动发光试剂(N aOH2H2O 2) 作用下, 鲁米诺发光, 发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erliteTM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。

增强发光酶免疫分析

(enhanced lum ines2cence enzym e imm unoassay, ELEIA )

在发光系统中加入增强发光剂, 如对2碘苯酚等, 以增强发光信号, 并在较长时间内保持稳定, 便于重复测量, 从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上, 还可通过计算机严密控制, 进行自动操作, 如加试剂, 混合, 温育, 洗涤, 加发光试剂, 发光计数, 数据处理, 绘制标准曲线, 直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。Am erliteTM 发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂, 其发光时间可持续长达20m in, 试剂盒有甲状腺功能检测的

促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素, 与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。

ALP标记的CLEIA

所用底物为环1, 22二氧乙烷衍生物, 这是一类很有前途的发光底物 , 用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基, 其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团, 在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 sp iroadam an2tane ) 42m ethoxy242( 3’2 pho spho ryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名为: 32(2’2 螺金刚烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P) 作用下, 磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基, 得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～ 30m in) , 此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子, 当其回到基态时产生470nm 的光, 可持续几十分钟(如图5)。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物, 可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10- 15mo l?L 。

美国DPC 公司的Imm u lite 全自动酶放大发光免疫分析仪, 以碱性磷酸酶为标记物, 以金刚烷作发光底物, 测定灵敏度相当于10- 21mo l?mL 的酶, 采用聚苯乙烯珠作载体, 其检测水平已能达到10- 12g?mL。

化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液，利用化学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊断。

化学发光免疫分析技术概要

一前言

化学发光(chemiluminescence)是指某些化学反应中发出可见光现象。最早发现的化学发光现象发生在生物体内，发光生物体广泛存在于自然界，大约有13大类近千种。1902年Schmitz最早合成的鲁米诺发光试剂被广泛用于血迹鉴定工作。

国外化学发光分析方面的研究在20世纪六七十年代得到迅速发展，直到现在，化学发光分析的研究和应用仍然是痕量分析领域的一个十分重要的研究方向。我国的化学发光研究工作起步比较晚，到20世纪70年代后期才有介绍文章，80年代才有原始性的研究报道。在过去的20多年中，我国的化学发光从无到有，从小到大，从国内走向国际，2004年9月第十一届发光光谱分析国际会议在北京召开，标志着我国的化学发光研究走上了一个新的台阶。随着光电转换技术的提高和计算机的普及和使用，化学发光仪器性能获得空前的提高，化学发光的研究和应用得到快速的发展，特别是在临床检验和环境检测方面已经成为不可缺少的分析方法。

化学发光检测技术在环保、食品安全、冶金、制药等其它领域也有广泛的应用前景，例如在环保领域对重金属、残留农药、水中有机污染物的检测，化学发光诊断试剂盒可广泛应用于传染性疾病、肥胖及相关疾病、内分泌系统、遗传病、肿瘤的早期诊断等，同时它还可以应用于环保监测、刑事侦查、海关检查、动植物检验检疫等众多领域。可以这样说，开