肾穿刺活检六胺银染色套染Masson染色方法的改良

号为鲜红色。本组实验对两种不同显色方法进行对比，结果示DAB显色操作比较简单，室温下即可显色，显色时间较快；显色后切片可用二甲苯透明，切片较干净，组织透明度较好；透明后用中性树胶封固，可较长时间保留切片，一般不会掉色；AEC显色颜色比较鲜艳，背景比较淡，敏感性和表达部位显色效果较好。相比之下，DAB显示的颜色比较暗，背景颜色比较重，敏感性和表达的部位不如AEC显色效果好；DAB有致癌性，使用时务必有防毒意识和防毒措施。而AEC显色需在37ħ烤箱中进行，不利于对显色结果进行判断；显色后不能用二甲苯进行透明处理，影响切片的透明度和清晰度；使用水溶性封片剂或甘油等封片不利于切片的长期保存，需及时观察、采集图像并进行统计学分析。两种显色剂和显色方法各有优缺点。

文献［1］报道DAB和AEC两种显色剂易受以下因素影响，如组织固定（固定液的温度、pH值和不同组织）、制片过程（浸蜡温度、包埋温度、烤片温度）、IHC染色过程（如抗原修复的方法、时间、温度、pH值，封闭内源性过氧化物酶的方法、步骤等）和ISH染色过程（如酶蛋白消化的时间、探针的敏感度）等，这些因素对染色结果影响很大。Graham等［2］研究发现使用氧化物酶组织化学的显色剂，可以使显色时间持续更久。

上述两种显色方法对IHC和ISH显色结果进行有效区别，若实验中仅采用其中一种方法时，DAB显色是首选，如果同时选用两种技术进行科学研究时，建议一种技术选用DAB显色，另一种技术选用AEC显色，因为DAB显色结果为棕黄色，EAC显色结果为红色，两种不同的显色颜色有利于操作人员进行视觉鉴别，避免混淆。在今后的工作中，我们建议实验操作人员要从习惯采用DAB显色逐步实践或过度到采用AEC显色，将更有利于环保和健康。

参考文献：

［1］熊正文，李春光，丁华野，等．影响免疫组化敏感性反应的因素分析及对策［J］．中国组织化学与细胞化学杂志，1999，8（2）：

236－9．

［2］Graham R C，Jr Karnowsky M J．The early stage of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney：ultrastructural cytochemistry by a new technique［J］．J Histochem Cytochem，1966，14（4）：291－

302．

肾穿刺活检六胺银染色套染Masson染色方法的改良

吕增华，张杨杨，朱玉红

关键词：肾穿刺活检；六胺银染色套染Masson染色法

中图分类号：R446文献标志码：B

文章编号：1001－7399（2012）11－1289－02

肾穿刺活检是目前诊断肾小球肾炎最可靠的手段，在肾脏穿刺活检病理诊断中，六胺银染色套染Masson染色［1］能精确显示病变肾小球内各种免疫复合物的形态与定位，对诊断肾小球疾病起着至关重要的作用。然而，此方法仍然存在制片时间长、染色效果不稳定等缺点，远不能满足临床需要。为此，本组实验对临床送检的120例肾脏穿刺标本，以传统的六胺银染色套染Masson染色方法为基础，在切片染色时间、方法和质量上进行了改进，现介绍如下。

1材料与方法

收稿日期：2012－07－12

作者单位：滨州医学院附属医院病理科，山东滨州256603

作者简介：吕增华，女，副主任技师。Tel：（0543）3256654，E-mail：bzlzh2010@163．com

张杨杨，女，技师，通讯作者。E-mail：zyy19871102@163．

com 1．1组织来源及处理选取临床肾脏穿刺活检标本120例。所有组织均用PB-FA液（40%甲醛10ml、无水乙醇70 ml、0．01mol/L、pH7.2PBS溶液20ml）固定。脱水、透明、浸蜡、包埋（浸蜡和包埋用蜡系熔点60ħ，溶解过滤后使用）。整个过程在3h内完成。包埋时务必将组织拉平，所有组织须在同一个包埋面上，切片厚1μm，64ħ烤箱烤片30 40min。

1．2储存液的配制按照说明书将国药公司生产的粉装试剂配制成储存液，步骤如下：（1）3%六次甲基四胺（乌洛托品）水溶液；（2）5%硝酸银水溶液棕色瓶装；（3）0.2%氯化金水溶液，前3种储备液4ħ冰箱保存备用；（4）5%硼砂水溶液；（5）0.25%硫代硫酸钠水溶液，（4）和（5）室温保存备用；（6）Masson复合染液（酸性复红1g，丽春红2g，橙黄G2 g，0.25%醋酸300ml）；（7）0.1%固绿水溶液，（6）和（7）室温避光保存备用。

1．3染色步骤（1）切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗；（2）擦干组织周围蒸馏水，滴加3%过碘酸水溶液20min，蒸馏水洗3次；（3）滴加预温的六胺银工作液，水浴60 65ħ染色20min左右（大号培养皿去盖先放入水浴锅预热，将组织切片放入培养皿，并滴加预温的六胺银工作液，在切片上加一塑料盖），镜下示肾小球基膜呈明显黑色，蒸馏水洗3次；

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临床与实验病理学杂志J Clin Exp Pathol2012Nov；28（11）

①②③图1切片厚1μm：PASM染色背景干净，结构清晰，细胞无重叠图2切片厚1μm：PASM染色切片布满难以清除的黑色沉淀图3切片厚3μm：PASM染色基膜线条增粗，着色过深，系膜细胞有重叠

（4）0.2%氯化金水溶液调色约2min镜下控制时间，蒸馏水洗3次；（5）浸入0．25%硫代硫酸钠水溶液2 3min，自来水洗3min；（6）Harris苏木精液染色3 5min，水洗；（7）1%盐酸水溶液分化数秒，自来水洗10min；（8）1%醋酸水溶液中过一下，滴加Masson染液5 7min，水洗；（9）滴加0．1%固绿水溶液2 3s，急入水洗；（10）梯度乙醇脱水，吹干，中性树胶封固。

2结果

经改良后的六胺银染色套染Masson染色法染出的切片显示肾小球基膜、肾小管基膜和毛细血管基膜均呈黑色，免疫复合物呈鲜艳的红色，细胞核呈紫蓝色，胞质和红细胞呈淡红色，背景干净，结构清晰，细胞无重叠（图1）。3μm厚的切片镜下显示肾小球结构不清楚，易造成细胞增生假象。染色操作时操作人员务必将切片处理干净，若处理不干净，容易有污迹，影响切片美观（图2、3）。

3讨论

六胺银染色套染Masson染色法是显示肾小球基膜常用的染色方法，在传统六胺银染色方法的基础上又向前推进了一大步，但在实际操作中影响染色效果的因素较多，有文献［2］报道六胺银溶液的温度对染色的效果有直接影响。现阶段应用微波技术改进六胺银染色效果成为热点，并且取得较为可观的染色效果［3］。微波炉加热存在诸多不稳定因素：微波照射时间很短，即使在相同功率和相同染色时间条件下，染色所用的器皿及形状、湿盒水量、水温、染液的起始温度、染液的量等对染色的结果均有较大的影响，易造成染色结果不稳定。若染色温度掌握不好，易对组织造成热损伤。因此，作者建议采用水浴加热法，将水浴温度提高到65ħ，切片着色快，染色均匀，背景干净，银染20min即可达到理想的染色效果，染色时间比传统染色时间缩短一半。若发现温度低于60ħ，组织着色反应缓慢，染色时间长，易出现黑色沉淀，且难以清除。温度高于65ħ，溶液易加速氧化反应而变浑浊，组织着色反应快，易过染，影响观察。

作者在实验中还发现，除了温度对染色效果影响外，切片厚度对镜下观察肾小球结构影响很大。传统的银染切片厚3μm，肾小球基膜线条明显增粗，着色过深，系膜细胞重叠，易导致基膜增厚变粗，产生系膜细胞增生的假象，不能真实反映其病理改变，使病理医师诊断困难，甚至引起误判。切片厚1μm时肾小球基膜着色均匀，结构清晰，线条流畅，细胞无重叠，利于病理医师判读。但要制出厚1μm的舒展切片对于经验不足的病理技师非常困难，本试验应用30%的乙醇2次漂片技术解决了这一难题。

改良后的六胺银染色套染Masson染色法对多种组织成分对比非常鲜明，不仅能准确显示肾小球基膜、系膜基质、胶原纤维和有无免疫复合物的沉积，并且易于识别沉积的部位和病变范围，对肾脏疾病的诊断和描述具有很大的支持作用。本实验采用滴染法，1次只需配制六胺银工作液300 500μl于Ep管内，染3 5张切片既能满足本院1次送检量的需要，与浸染相比大大节约了染色成本，提高了经济效益。该方法快速、简便、结果稳定，同时也为患者赢得宝贵时间，且不需要特殊设备，适合各级医院工作开展，值得推广应用。

参考文献：

［1］余英豪，郑智勇．肾穿刺活检病理诊断彩色图谱［M］．福州：福建科学技术出版社，2008：64－5．

［2］骆秀兰，蔡秀玲，王朝杰，等．肾小球基膜六胺银染色的比较［J］．临床与实验病理学杂志，2005，20（4）：493－4．

［3］熊正文，李艳红，杜欣，等．光波-微波辐射技术在肾小球基膜六胺银染色中的应用研究［J］．中国中西医结合肾病杂志，2007，8（4）：229－30．

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