根癌农杆菌Ti质粒简介

生 物 学ห้องสมุดไป่ตู้ 学 ２０１８年（第４３卷）第６期
· ６５ ·
根 癌 农 杆 菌 Ｔｉ质 粒 简 介
王裕鹏 （海南省洋浦经济开发区洋浦中学 ５７８０００）
摘 要 本 文 以高 中知 识 为 背 景 ，对 根 癌 农 杆 菌 中 Ｔｉ质 粒 的 分 类 、结 构 、转 化 机 理 和 基 因工 程 中 的适 用 范 围进 行 归 纳 总 结 。 关键词 根癌农杆菌 Ｔｉ质粒 Ｔ—ＤＮＡ区 双元载体系统
在过去的几十年 间 ，关 于根 癌农杆 菌转 化植 物 细 胞的分子机制得 到 了广泛研 究 。 目前 ，人们 普遍 认 同 Ｔｉ质粒转 化过程可分 为 ８个 相互 关联 的 阶段 ，分 别
为 ：① 当植物受到创 伤后 ，会 分泌酚类 化合物 ，吸引农 杆菌移 向植物细胞 ，然后与植物细胞相关受体蛋 白特异 性结合 ；＠ＶｉｒＡ蛋白是位于细菌细胞膜上 能识别植物酚 类化合物的受体 蛋 白，两者结 合后 引发 ＶｉｒＧ蛋 白的磷 酸化 ；③ 由于 Ｖｉ 蛋 白磷 酸化 ，使其从非 活性状 态转变 至活性状态 ，并作 为激 活因子结合 至其他 Ｖｉｒ基 因的启 动子上 ，开启 Ｖｉｒ基 因表达 ；④ＶｉｒＤ１和 ＶｉｒＤ２蛋 白作 用 于 Ｔ—ＤＮＡ的底链上 ，将其切割形成单链 Ｔ—ＤＮＡ分子 （即 Ｔ—ｓｔｒａｎｄ）；同 时 ＶｉｒＤ２蛋 白以共 价 方式 连 接在 Ｔ— ｓｔｒａｎｄ的 ５ 端 ，形成一个不成熟 Ｔ链 复合物 ；⑤ ＶｉｒＤ４和 ＶｉｒＢ类蛋 白结合形成具有转运功能的通道 ，协助不成熟 Ｔ链复合物和一些 Ｖｉｒ蛋 白进入植物 细胞 中；⑥在转运 途 中，ＶｉｒＥ２蛋 白包被在不成熟 Ｔ链 复合物上 ，构成成熟 Ｔ链复合物 ；⑦成 熟 Ｔ链 复 合物 和一 些植物 细胞 蛋 白 （Ｒａｎ、ＶＩＰ１等）进一步识 别结合 ，协 助 Ｔ链复合物经核 孔到达细胞核 ；⑧在 ＶｉｒＤ２、ＶｉｒＥ２和植物 细胞相 关蛋 白 的协助下 ，Ｔ—ｓｔｒａｎｄ与植物细胞基 因组完成整合 。 ３ Ｔｉ质 粒 在 实 际应 用 中 的 改 造
高 中生物学教材提 到用 于基因工程 的载体 分子量 并不 大 ：如 ＴＡ 克 隆 用 到 的 ｐＭＤ１９质 粒 长 度 仅 有 ２６９２ ｂｐ，原核表达 蛋白质 常用质 粒 ｐＥＴ一２８ａ长度也只 有５３６９ ｂｐ。而 Ｔｉ质粒 长度 约 ２００ Ｋｂ左右 ，片段 过大 ， 不易操作 。所 以野 生 型 Ｔｉ质粒 需改 造才 能应 用 于植 物 基 因工 程 。
人教 版高 中生 物学教 材选修 ３中提 到 ，将 目的基 因导入植 物 细胞 的方 法 中采 用 最多 的是 农 杆 菌 转化 法 ，其 中根癌农杆 菌细胞中的 Ｔｉ质 粒在 整个转 化过程 中起 到了关键 作用 。本 文 就 Ｔｉ质粒 相关 知识 进 行梳 理 和 总结 。 １ Ｔｉ质粒 的分类 和结构 １．１ Ｔｉ质粒 的分 类 农杆 菌是一 类 能侵染 植物 受损 伤部 位 ，进 而引起植 物细胞 产生冠 瘿碱 和毛状根 的革 兰 氏阴性 土壤杆 菌。它包括根 癌农 杆菌和发 根农杆菌 两类 。而致 瘤 质粒 （ｔｕｍｏｒ—ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ，简 称 为 Ｔｉ 质粒 ）是根癌农杆 菌细胞 拟核 区外 分离 到 的一种 能 自 主复制的双链环状 ＤＮＡ分 子 ，长度约为 ２００～２５０ Ｋｂ。 Ｔｉ质粒可 以诱导植物 细胞 产生不 同种类 的冠瘿碱 ，根 据产生冠瘿碱 的类型 ，Ｔｊ质 粒 可以分 为 ４类 ：章鱼 碱 型 、胭脂碱型 、农杆碱型和琥珀碱 型…。 １．２ Ｔｉ质 粒 的结 构 从 结 构上 看 ，Ｔｉ质粒 包 括 Ｔ— ＤＮＡ 区、毒性 区、接合转移 区和复制起始 区 ４部分 。其 中 ，Ｔ—ＤＮＡ 区和毒 性 区参与 了外源基 因的转移 整合 ， 其结构特 点如下 ：①Ｔ—ＤＮＡ 区。该 区是根 癌农杆 菌 侵染植物细胞时 ，Ｔｉ质粒 在相 关蛋 白的作 用下 被切 割 下来 整合至植物 基 因组 的一段 ＤＮＡ分 子。该 区段 分 布一些 与激素合 成相关 的基 因 ，其表 达产物 能引起 植 物细胞激素紊乱 ，进而导致肿 瘤 的形 成 。由于 Ｔｉ质 粒 类 型不同 ，Ｔ—ＤＮＡ长度也 有所不 同 ，总体 介于１２—２４ Ｋｂ之间 。其最重要 的 区域是 分别 位 于左 右两端 边 界 处 ２５ ｂｐ的重 复序 列 ，两者在 Ｔ—ＤＮＡ转移外 源基 因整 合 至植物 基 因组 中发挥 功能 ，其 中右边 界序列 的作 用 更 为重要 。② 毒性 区（Ｖｉｒ区 ）。该 区是 位 于 Ｔ—ＤＮＡ 以外 的一段 ＤＮＡ分子 ，长度 介于 ３０～４０ Ｋｂ之 间。不 同类 型的 Ｔｉ质粒 Ｖｉｒ区结构也 有所 不 同 ，以胭脂 碱 型 ｒｒｉ质粒为例 ，其 Ｖｉｒ区有 ７个操 纵子 ，共 ２２个 基 因，分 别 为 ， Ｊ—ＶｉｒＢ１１，ＶｉｒＣ１，ＶｉｒＣ２，ＶｉｒＤ１一Ｄ４， ＶｉｒＥ１，ＶｉｒＥ２，ＶｉｒＧ，Ｖｉｒｔｚｓ。这 些 基 因 编 码 的 蛋 白 质 在 Ｔ—ＤＮＡ转移整 合 中起辅 助作 用 ，其本 身 不会 与植 物 基 因组 整合 。 ２ Ｔｉ质粒 的转化 机理
关 于 Ｔｉ质 粒 的 改 造 方 法 中 最 常 见 的 是 双 元 载 体 系统 …。前 面提 到 Ｖｉｒ区对 Ｔ—ＤＮＡ的转移至关重要 ， 但它并没有和 Ｔ—ＤＮＡ区 连在一 起 。基 于此 ，可 以把 这两个 区段分别 改造 到两个 质粒 上 。通 常是将 含 Ｔ— ＤＮＡ 的质粒称之为微 型 Ｔｉ质 粒 ，它缺 失 Ｖｉｒ基 因，但含 有复制起点 、标 记 基 因和 多克 隆位 点 ，能 整 合外 源 基 因 。由于该质粒在大肠杆菌和农杆菌 中均可 以复制 保 存 ，也称之为大肠杆菌一农杆菌穿梭质 粒 。将含一 整套 Ｖｉｒ区基 因但缺失 Ｔ—ＤＮＡ区的质粒称 之为辅 助 Ｔｊ质 粒 。两种质粒构建 完成 后 ，采 用一 定 的方 法将 它们 转 入 同一 株 农 杆 菌 中 ，构 成 双 元 载 体 系 统 ，就 能 使 Ｔ—ＤＮＡ整合至植物基 因组 中。此外 ，人们还建立 了共 整合载体 、超级 双元 载体等系统 。 ４ Ｔｉ质 粒 在 基 因工 程 中 的 适 用 范 围