2009年中标973项目标书

2009年中标973项目标书:恶性肿瘤非编码RNA相关蛋白的功能网络与调控机制的研究(7)

2009年08月12日 19时33分44秒来源：未知浏览：6377次

（1）RNA组学平台在肿瘤特异ncRNA筛选中应用：本研究将采用RNA

组学方法，并结合深度测序和计算生物学方法，建立高通量筛选和鉴定ncRNA

技术平台，将有效地发现不同长度和类型的新的肿瘤特异的ncRNA。

（2）肿瘤相关ncRNA相互作用蛋白系统研究：本研究采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、酵母三杂交技术、SELEX技术、CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法以及蛋白复合体分离检测技术等多种新技术新方法，并有机结合计算生物学方法，理论与实验科学相结合，高通量和特异性相结合，是一种新的ncRNA相互作用蛋白研究策略。这也是国内首次开展大规模的肿瘤特异的ncRNA及其相关蛋白的发现和作用机制研究。

3.课题设臵

1）课题设臵的思路

本研究项目从发现和鉴定恶性肿瘤特异的非编码RNA(ncRNA)与其相关蛋白质出发，分别从ncRNA调节轴心的上游和下游研究ncRNA和相关蛋白的相互作用及相互调控机制，并阐述ncRNA及其相关蛋白在肿瘤自然发生发展和治疗抵抗等病理过程中的作用。课题的设臵围绕这一学术思路展开，分为4个分课题：（1）肿瘤ncRNA及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究；（2）肿瘤ncRNA转录加工相关蛋白的功能研究；（3）ncRNA相关蛋白对肿瘤启动细胞和肿瘤转移的调控作用，及其与肿瘤发生发展的关系；（4）ncRNA相关蛋白质调控肿瘤细胞程序性死亡以及治疗抗性的功能研究。

课题一：肿瘤非编码RNA及其相互作用蛋白的系统识别与机制研究

1.研究内容：

1）筛选和鉴定新的肿瘤相关非编码RNA

以人常见肿瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)细胞系和人癌组织及正常组织标本为研究对象，建立和发展高通量ncRNA筛选和鉴定技术平台，针对不同的研究目的采用多种不同途径获得肿瘤特异的ncRNA分子。具体技术途径可包括：(1)采用RNA组学研究方法，分离制备RNA，采用罗氏454测序技术或Illumina Solexa 测序技术等方法，进行高通量测序分析和大规模筛选。（2）分离制备ncRNA分子，构建不同大小的ncRNA的cDNA文库(size-fractioned RNA library) （包括我们建立非编码小分子RNA建库技术，FEBS lett.2005,579: 3849-3854）和消减文库，对文库进行大规模筛选和高通量测序分析。(3)采用Invitrogen公司最新推出的为检测长ncRNA设计的NCode Noncoding RNA Array（包含17112个人ncRNA分子）获得肿瘤特异的长度大于200bp的候选ncRNA分子；采用miRNA 芯片分析，获得肿瘤特异的候选miRNA分子。针对获得的新数据和已有数据，结合生物信息学方法高通量发现新的不同长度和类型的ncRNA分子，获得常见肿瘤ncRNA表达谱，筛选差异表达ncRNA，获得常见肿瘤特异表达的候选ncRNA分子。

针对获得的肿瘤特异的候选ncRNA分子，采用Northern blot、原位杂交和/或实时定量PCR等技术对大样本肿瘤和正常组织标本及癌细胞系进行进一步鉴定分析，最终获得肿瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)ncRNA表达谱和特异表达ncRNA。

2）系统分析和鉴定肿瘤特异非编码RNA的相互作用蛋白质

建立和完善规模化的肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质发现、筛选和分析的规范化技术体系，获得一批与肿瘤特异ncRNA相互作用蛋白质分子。针对获得的肿瘤特异ncRNA分子，采用基于生物质谱分析的蛋白质组学技术、筛选和鉴定RNA与蛋白质相互作用的酵母三杂交技术、SELEX(systematic evolution of Ligands by exponential enrichment)技术、免疫沉淀-RNA:随机聚合酶链反应方法，以及CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白复合体分离检测技术，结合生物信息学技术，筛选、鉴定肿瘤特异性ncRNA相互作用候选蛋白质。经肿瘤细胞内外验证，获得一批肿瘤ncRNA相互作用蛋白质分子，为ncRNA相关蛋白的生物学功能研究提供保证。

miRNA是目前哺乳动物细胞研究最成熟的ncRNA，在分析和鉴定miRNA靶基因蛋白方面，本项目研究人员中山大学生科院的蒋嵩山副教授前期的研究构建了600多个人miRNA基因的慢病毒表达载体和质粒表达载体，通过内源性提高miRNA 的表达，并进行蛋白质组学分析，系统地筛查肿瘤相关miRNA的靶基因。结合通过同位素标记氨基酸的SILAC方法，可获得相关度非常高的miRNA-靶蛋白调节关系。在生物信息学软件预测的参考下，通过荧光素酶报告系统对miRNA-靶蛋白调节关系进行鉴定，最终系统地获得肿瘤相关miRNA的调节谱，作为后续研究的基础。

3）肿瘤特异非编码RNA与相互作用蛋白的作用机制

阐明ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规律对揭示ncRNA与相互作用蛋白质分子的作用机制具有重要意义。首先针对获得的ncRNA相互作用蛋白质，采用计算生物学方法，以实验证实的ncRNA与蛋白相互作用为基础，开展基于机器学习的ncRNA与蛋白相互作用研究。探讨三个问题：①与某一特定蛋白结合的若干RNA的结合区特征识别；②与某一特定类型RNA结合的若干蛋白的结合区特征识别；③开展基于机器学习的ncRNA与蛋白相互作用的预测研究，构建分类模型，预测与某一特定ncRNA结合的所有可能蛋白或与某一蛋白结合的所有可能ncRNA，最终为实验提供计算生物学支持。结合计算生物学的分析结果，对获得的肿瘤特异的ncRNA分子进行碱基或序列片段进行替换、缺失，采用规模化研究

蛋白质与RNA相互作用技术在细胞内外探索ncRNA与蛋白质相互作用，揭示蛋白质-ncRNA的相互作用方式，进而发现ncRNA与蛋白质相互作用的序列和结构规律，为基础和应用研究提供条件。

4）肿瘤特异非编码RNA相互作用蛋白在肿瘤中的定性、定量和定位研究针对获得的肿瘤特异ncRNA及其相互作用蛋白质，对各种常见肿瘤标本进行定性、定量和细胞定位分析，揭示其在肿瘤中表达的动态时空关系。应用Northern Blot、实时定量RT-PCR技术和原位杂交等原位技术对肿瘤相关ncRNA 的表达进行定位和定性研究，以确认肿瘤相关ncRNA及其相关的靶基因蛋白在恶性肿瘤中的上调/下调关系。应用Western Blot和免疫组织化学技术，对肿瘤相关ncRNA相关蛋白在恶性肿瘤中的表达进行定量或半定量检测。结合表达谱筛选数据，对肿瘤相关ncRNA及相互作用蛋白的角色即癌基因/抑癌基因进行确认，并与功能研究衔接。

2.研究目标：

1）建立肿瘤非编码RNA相互作用蛋白质高通量筛选和分析技术平台。

2）系统分析和鉴定一批新的不同长度和不同类型肿瘤特异性非编码RNA及相关蛋白，揭示非编码RNA及相关蛋白的相互作用机制。

承担单位：军事医学科学院

课题负责人：郑晓飞研究员

经费比例：23.71%

课题二：肿瘤非编码RNA转录加工相关蛋白的功能研究

1.研究内容：

1）肿瘤ncRNA表达的表观遗传调控

DNA甲基化和组蛋白修饰是ncRNA表观遗传学调控的主要形式，ncRNA之间的表达调控也属于表观遗传学调控的范畴。首先通过分析肿瘤表观遗传学改变与ncRNA表达谱之间的关系获得候选的表观遗传学调控的ncRNA。然后验证ncRNA 表达和启动子区域DNA甲基化的对应关系，并比较DNA甲基化酶抑制剂（DAC）处理前后相关ncRNA的表达情况，确认ncRNA表达受DNA甲基化调控。应用抗活