分子生物学实验讲义final

实验安排

实验一PCR引物设计

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。

1.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区：某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

3.长度：寡核苷酸引物长度为15-30bp，一般为20-27bp。引物的有效长度Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量:G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身:引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构影响引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp。

7.引物之间:两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端；引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

9.引物的5′端：设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。

10.密码子的简并：如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

11.简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物，只知道目的片段氨基酸序列而不知其具体核酸序列时使用。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。同时，简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'

端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

实验二哺乳动物细胞总RNA的提取、电泳

一、实验目的

学习并掌握总RNA的分离提取，检测质量以及定量的方法。

二、实验原理

细菌的总RNA主要由rRNA、tRNA及mRNA组成，其中rRNA含量最多（占80%~85％）。在pH 6.0微酸环境下，RNA相对稳定，碱性环境下，易分解。

RNA酶极为稳定且广泛存在于细胞内外，环境中存在大量RNA酶，极易降解RNA，因而在RNA提取及相关分析实验中，如何避免RNA酶的污染及抑制内源和外源性RNA活性,是实验成败的关键。

在RNA相关实验过程中，须树立RNase-free思想：1）样品新鲜，保存得当，以强变性剂，防止内源性RNase；2）人体上遍布RNase,养成操作时勤换一次性手套和口罩的好习惯；3）空气中灰尘和细菌含RNase，应建立干净的操作环境；

实验介绍如何使用TRIzol来分离总RNA。TRIzol是一种酸性苯酚提取试剂，含有去垢剂，和使RNase失活的异硫氰酸胍，它能在破碎和溶解细胞时保持RNA的完整性，防止RNA降解。（注意：TRIzol 具有强烈腐蚀作用，小心操作。）

三、实验材料、试剂与器材

1、细胞（5х106Hela）

2、DEPC水溶液，PBS，TAE

3、氯仿，异丙醇，乙醇均为分析纯

4、TRIzol试剂购自Invitrogen

5、烧杯（1000，500，100，50ml若干），量筒（1000，500，250，50，20 ml 若干），玻璃棒，药勺，试剂瓶，三角瓶。枪头（1000、200、20 ul），离心管(0.2ml、0.5ml PCR管,1.5ml、2ml、7ml离心管)，枪头盒。

四、实验步骤

1.RNA提取前的准备

1）、玻璃器皿，金属及耐250℃物品的处理：

于高温烘箱中干烤，180℃，5小时，干烤前均用锡箔纸密封器皿头部。

2）、塑料制品的处理：

0.05-0.1%的DEPC （焦碳酸二乙酯水）浸泡过夜：

●必须保证塑料制品被水浸透，内部没有气泡，对于小枪头、0.2ml、0.5ml PCR

管，必要时应用枪逐个的用水灌注（这一步对于以后的实验保证非常重要，须小心操作）。

●泡过夜后，用镊子逐个敲去管内的DEPC水，装于干烤过的烧杯，加锡箔纸

密封杯口；尽量敲去枪头内的水，装于处理过的枪头盒，报纸包好。

●121℃，30分钟高压灭菌，以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作

用而破坏mRNA活性，且抑制后继酶促反应，烘干，备用。

●DEPC是蛋白质强变性剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑

制酶活性。具强挥发性，致癌物,因而使用时应在通风橱操作，需戴一次性手套，一次性口罩，小心操作。

3）、试剂的配制：

试验所用试剂也可用DEPC处理过夜，再高压灭菌,但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理，可用DEPC处理的水配制，并尽可能用未曾开封的试剂，然后高压灭菌。

所需烧杯等必须干烤处理以后方可用。

0.05-0.1‰的DEPC水（三蒸水），磁力搅拌器搅拌过夜或者摇床低速振荡过

夜，121℃，30分钟高压灭菌。