免疫学检测原理及临床应用
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• 凋亡早期，细胞表面变 化 ，磷脂酰丝氨酸 （PS）外翻。
• ANNEXIN V是种磷脂结 合蛋白，作为探针能识 别凋亡细胞。
• 细胞对细胞活性染料 （如PI）有拒染性。而 坏死细胞能被PI染色。
（二）淋巴细胞功能测定的体内试验
迟发型超敏反应皮肤试验 ●特异性: PPD皮试、过敏原皮试 ●非特异性: PHA 皮试、DNCB皮试
（三）抗原特异性T淋巴细胞检测
MHC/多肽四聚体技术（Tetramer-Technology）
T细胞表面的T细胞受体( TCR)可 特异性识别、结合抗原提呈细胞或靶 细胞表面的MHC-抗原肽复合物。
体外将MHC分子与抗原肽进行复 性重叠形成MHC-肽复合物。用荧光素 标记的亲和素把四个MHC-肽单体形成 MHC四聚体可以结合到特异性的CTL 表面。
是指一个抗体分子与整 个抗原之间的结合强度。
之间的结合强度。
High
Affinity Ab
Low
Affinity Ab
Keq =
104
106
Ag
Ag
Avidity Avidity
抗原抗体反应的基本检测方法
（一） 凝集反应 颗粒性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下
形成肉眼可见的凝集块。 （二） 沉淀反应
●流式细胞术(flow cytometry，FCM)
●磁分离技术
（三）淋巴细胞亚群计数
●免疫荧光技术（IF） ●补体依赖微量细胞毒试验 ●流式细胞术（FCM） ●花环试验
用FITC-抗IgM 单抗计数B细胞
二、淋巴细胞功能测定
3H-TdR渗入法
淋巴细胞增值试验 MTT法 形态学计数法
体外试验
抗人球蛋白
抗RBC 抗体
RBC
直接抗球蛋白试验（DAT） 阳性（右）
沉淀反应(precipitation)
单扩的原理 双扩的原理
免疫电泳
补体参与的反应
溶血空斑试验 补体依赖细胞毒实验（已操作）
补体结合试验
淋巴细胞毒交叉配合试验 lymphocyte cross matching
将含有细胞毒抗体的受者血 清与供者的淋巴细胞加入补 体后一起培养。
②用已知抗体检测未知抗原，鉴定病原体或 辅助诊断疾病
抗原-抗体反应的特点与影响因素
特点：
特异性 可逆性 阶段性 可见性（合适 的抗原抗体比例）
反应条件：
适当的温度 电解质 酸碱度
●亲和力与亲合力（affinity & avidity）
• 亲和力(affinity)
• 亲合力(avidity)
是指一个抗体上一个抗 原结合位点与抗原决定基
第3节 免疫分子的检测
一、免疫球蛋白的测定 单扩，ELISA、RIA，免疫电泳等
二、补体测定 单扩，ELISA、RIA， CH50
三、细胞因子检测 1. 免疫学测定法
●分泌性细胞因子检测：ELISA, RIA, ELISPOT, WB, immuno-PCR
●胞内细胞因子检测：FCM
2. 生物活性测定法
促进细胞增殖和增殖抑制法, 抗病毒活性测定 法, 直接杀伤法, 趋化活性测定法
放射免疫测定法(radioimmunoassay， RIA) 化学发光免疫分析
免疫印迹法 (immunoblot)
免疫层析检测原理
第2节 免疫细胞的检测
一、免疫细胞分离及其亚类计数
(一) 外周血单个核细胞（ PBMC）的分离
（二）淋巴细胞亚群的分离
●尼龙棉分离法 ●E花结分离法
●流式细胞术(flow cytometry，FCM)
可溶性抗原与相应的抗体结合后，在一定条件 下出现肉眼可见的沉淀线或沉淀物。 （三） 补体参与的反应 （四） 免疫标记技术
凝集反应 (agglutination)
间接凝集
直接凝集
间接凝集抑制
间接凝集反应
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是一组B淋巴细 胞功能异常亢进、产生抗自身红细胞抗体、使红细胞 破坏增加而引起的贫血。
●方法：核素掺入法、MTT法和形态学计数法
淋巴 细胞 增殖 实验 （核 素掺 入法）
2. 细胞毒试验
CTL、NK细胞可直接杀伤靶细胞（如肿瘤 细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等）
● 51Cr释放法
● LDH释放法
DNA Ladder
● 细胞凋亡检查法
电 泳 图 谱
TUNEL法检测凋亡细胞
流式细胞术----Annexin-V/PI双染法
免疫学检测原理及临床应用
免疫学检测指借助免疫学、细胞生 物学、分子生物学等理论或方法，对抗 原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行 定性、定量检测。
内容提要
一、抗原抗体检测 二、免疫细胞检测 三、免疫分子检测 四、免疫相关基因检测
第1节 基于抗原-抗体反应的检测方法
①用已知抗原检测未知抗体，诊断有关疾病
细胞毒试验
51CR释放法 乳酸脱氢酶释放法
细胞凋亡检查法
分泌功能测定 体内试验：皮试
检测细胞因子分泌细胞 检测抗体形成细胞
二、淋巴细胞功能测定
（一）淋巴细胞功能测定的体外试验
1. 淋巴细胞增殖试验
●刺激物
* 非特异性：丝裂原PHA、Con A和PWM，抗CD2、 CD3Fra Baidu bibliotek抗，同种MHC等
* 特异性：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌、肿瘤 细胞等
ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是 细胞频率；（整体水平与单细胞水平）
ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT 是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）
免疫组化技术 (immunohitochemistry techenique)
乳腺癌的CerbB2抗体免疫组化DAB染色
检测α-地贫的标志蛋白― Zeta链蛋 白，其检测结果可作为诊断α-地贫 的基本依据。
世界上唯一用ELISA方法检测SARS抗原 的试剂盒，发病第一天即可检出
BAS-ELISA
(ELISPOT)
酶联 免疫 斑点 试验
ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法， 是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最 大的不同:
一般要求死亡细胞少于15%。 若高于15%，移植后可能出 现超急性排斥反应。
免疫标记技术
colloidal gold
免 疫 荧 光 技 术
酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA)
酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)
• ANNEXIN V是种磷脂结 合蛋白，作为探针能识 别凋亡细胞。
• 细胞对细胞活性染料 （如PI）有拒染性。而 坏死细胞能被PI染色。
（二）淋巴细胞功能测定的体内试验
迟发型超敏反应皮肤试验 ●特异性: PPD皮试、过敏原皮试 ●非特异性: PHA 皮试、DNCB皮试
（三）抗原特异性T淋巴细胞检测
MHC/多肽四聚体技术（Tetramer-Technology）
T细胞表面的T细胞受体( TCR)可 特异性识别、结合抗原提呈细胞或靶 细胞表面的MHC-抗原肽复合物。
体外将MHC分子与抗原肽进行复 性重叠形成MHC-肽复合物。用荧光素 标记的亲和素把四个MHC-肽单体形成 MHC四聚体可以结合到特异性的CTL 表面。
是指一个抗体分子与整 个抗原之间的结合强度。
之间的结合强度。
High
Affinity Ab
Low
Affinity Ab
Keq =
104
106
Ag
Ag
Avidity Avidity
抗原抗体反应的基本检测方法
（一） 凝集反应 颗粒性抗原与相应的抗体结合，在一定条件下
形成肉眼可见的凝集块。 （二） 沉淀反应
●流式细胞术(flow cytometry，FCM)
●磁分离技术
（三）淋巴细胞亚群计数
●免疫荧光技术（IF） ●补体依赖微量细胞毒试验 ●流式细胞术（FCM） ●花环试验
用FITC-抗IgM 单抗计数B细胞
二、淋巴细胞功能测定
3H-TdR渗入法
淋巴细胞增值试验 MTT法 形态学计数法
体外试验
抗人球蛋白
抗RBC 抗体
RBC
直接抗球蛋白试验（DAT） 阳性（右）
沉淀反应(precipitation)
单扩的原理 双扩的原理
免疫电泳
补体参与的反应
溶血空斑试验 补体依赖细胞毒实验（已操作）
补体结合试验
淋巴细胞毒交叉配合试验 lymphocyte cross matching
将含有细胞毒抗体的受者血 清与供者的淋巴细胞加入补 体后一起培养。
②用已知抗体检测未知抗原，鉴定病原体或 辅助诊断疾病
抗原-抗体反应的特点与影响因素
特点：
特异性 可逆性 阶段性 可见性（合适 的抗原抗体比例）
反应条件：
适当的温度 电解质 酸碱度
●亲和力与亲合力（affinity & avidity）
• 亲和力(affinity)
• 亲合力(avidity)
是指一个抗体上一个抗 原结合位点与抗原决定基
第3节 免疫分子的检测
一、免疫球蛋白的测定 单扩，ELISA、RIA，免疫电泳等
二、补体测定 单扩，ELISA、RIA， CH50
三、细胞因子检测 1. 免疫学测定法
●分泌性细胞因子检测：ELISA, RIA, ELISPOT, WB, immuno-PCR
●胞内细胞因子检测：FCM
2. 生物活性测定法
促进细胞增殖和增殖抑制法, 抗病毒活性测定 法, 直接杀伤法, 趋化活性测定法
放射免疫测定法(radioimmunoassay， RIA) 化学发光免疫分析
免疫印迹法 (immunoblot)
免疫层析检测原理
第2节 免疫细胞的检测
一、免疫细胞分离及其亚类计数
(一) 外周血单个核细胞（ PBMC）的分离
（二）淋巴细胞亚群的分离
●尼龙棉分离法 ●E花结分离法
●流式细胞术(flow cytometry，FCM)
可溶性抗原与相应的抗体结合后，在一定条件 下出现肉眼可见的沉淀线或沉淀物。 （三） 补体参与的反应 （四） 免疫标记技术
凝集反应 (agglutination)
间接凝集
直接凝集
间接凝集抑制
间接凝集反应
自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是一组B淋巴细 胞功能异常亢进、产生抗自身红细胞抗体、使红细胞 破坏增加而引起的贫血。
●方法：核素掺入法、MTT法和形态学计数法
淋巴 细胞 增殖 实验 （核 素掺 入法）
2. 细胞毒试验
CTL、NK细胞可直接杀伤靶细胞（如肿瘤 细胞、移植供体细胞、病毒感染细胞等）
● 51Cr释放法
● LDH释放法
DNA Ladder
● 细胞凋亡检查法
电 泳 图 谱
TUNEL法检测凋亡细胞
流式细胞术----Annexin-V/PI双染法
免疫学检测原理及临床应用
免疫学检测指借助免疫学、细胞生 物学、分子生物学等理论或方法，对抗 原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行 定性、定量检测。
内容提要
一、抗原抗体检测 二、免疫细胞检测 三、免疫分子检测 四、免疫相关基因检测
第1节 基于抗原-抗体反应的检测方法
①用已知抗原检测未知抗体，诊断有关疾病
细胞毒试验
51CR释放法 乳酸脱氢酶释放法
细胞凋亡检查法
分泌功能测定 体内试验：皮试
检测细胞因子分泌细胞 检测抗体形成细胞
二、淋巴细胞功能测定
（一）淋巴细胞功能测定的体外试验
1. 淋巴细胞增殖试验
●刺激物
* 非特异性：丝裂原PHA、Con A和PWM，抗CD2、 CD3Fra Baidu bibliotek抗，同种MHC等
* 特异性：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌、肿瘤 细胞等
ELISA测定的是蛋白浓度，ELISPOT测定的是 细胞频率；（整体水平与单细胞水平）
ELISA是免疫检测Immuno-Assay，而ELISPOT 是生物检测Bio-Assay（活细胞，功能检测）
免疫组化技术 (immunohitochemistry techenique)
乳腺癌的CerbB2抗体免疫组化DAB染色
检测α-地贫的标志蛋白― Zeta链蛋 白，其检测结果可作为诊断α-地贫 的基本依据。
世界上唯一用ELISA方法检测SARS抗原 的试剂盒，发病第一天即可检出
BAS-ELISA
(ELISPOT)
酶联 免疫 斑点 试验
ELISPOT 和 ELISA的区别
ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破传统 ELISA 法， 是定量 ELISA 技术的延伸和新的发展，它们最 大的不同:
一般要求死亡细胞少于15%。 若高于15%，移植后可能出 现超急性排斥反应。
免疫标记技术
colloidal gold
免 疫 荧 光 技 术
酶免疫测定 (enzyme immunoassay, EIA)
酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)