基因治疗技术与应用·

1.1 单基因病
• 如果一种遗传病的发病仅涉及一对基因，它所导 致的疾病就是单基因病。 • 包括以下几类： 常染色体显性遗传病 常染色体隐性遗传病 X连锁显性遗传病 X连锁隐性遗传病 Y连锁遗传病
1.1.1 常染色体显性遗传病
• 常染色体显性遗传病只要有一个致病基因便会表现 症状,患者的子代有50%也是患者，而且世代相传。
• 是一种简单易行的方法，如肌肉注射、静 脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但其 缺点是转染率较低。
2.2.1.2 间接体内疗法
• 间接体内疗法最常用的技术有3种 1. 体外处理疗法：
将有基因缺陷的体细胞取出后，引入正常的基因拷贝后 再送回体内；
2. 原位疗法：
使用载体将目的基因直接导入靶细胞；
3. 体内疗法：
基因治疗技术与应用
授课人：授课时间： 2015.1.9
内容
基因缺陷病
基因治疗
基因治疗的应用
1.基因缺陷病
• 基因是具有遗传效应的DNA分子片段。位于染色 体上，呈线性排列。基因不仅可以通过复制把遗 传信息传递给下一代，还可以使遗传信息得到表 达。人类只有一个基因组，大约有5～10万个基 因。当正常单个基因的DNA碱基对排列出现异常 时，如碱基对置换、增添或缺失而引起基因结构 变化，称作点突变。功能基因也可能部分片段或 整个丢失，从而导致基因病。 • 基因病主要分为单基因病和多基因病两大类。
1.2.5 膜转运蛋白病——先天性半乳糖吸
收不良症
• 小肠上皮细胞转运葡萄糖、半乳糖的膜载体蛋 白异常，致使葡萄糖和半乳糖吸收障碍，患者 肠道内渗透压改变而使肠液增加，患者出现水 样腹泻。
1.3 多基因病
• 如果一种遗传病的发病涉及多个基因，由多个微 效的基因累加作用共同影响下造成的疾病称作多 基因病。多基因遗传病发病也受环境因素的影响， 患者同胞的发病率大约仅1%～10%。 • 常见的多基因遗传病有消化性溃疡、原发性高血 压、先天性心脏病、哮喘、精神分裂症、无脑儿、 糖尿病等，以及先天畸形（唇腭裂、脊柱裂、无 脑儿等）。
2.1.2.2 分子化疗
• 自杀基因疗法： TK基因、CD基因 • 化疗保护性基因治疗： MDR基因 • 药物增敏基因治疗： 钙调素基因
2.1.2.2.1 自杀基因疗法
• 自杀基因（suicide gene)，前体药物酶 转化基因。
自杀基因 + 病毒载体
转染 药物前体 无毒
重组载体
Gene→酶→
• 直接策略 针对致病基因 • 间接策略 导入与致病基因无直接联系的治疗基因
2.1.1 直接策略
针对致病基因
• 基因修正（gene correction）
•
•
基因替代（gene replacement）
基因增强（gene augmentation）
•
基因干预（gene interference）
2.1.1.1 基因修正
含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号 构建、包装
特点、问题
3.2.2.2 腺病毒载体
• 基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb • 通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率 高。 • 不整合宿主基因组，安全。 • 宿主细胞范围广泛。 • 可口服、喷雾吸入或气管内滴注。 • 载体容量大。 • 体外容易培养制备，病毒滴度较高。
• • • • • 血红蛋白病 血浆蛋白病 结构蛋白缺陷病 受体蛋白病 膜转运蛋白病
1.2.1 血红蛋白病——镰状细胞贫血症
1.2.2 血浆蛋白病——血友病
• 血友病A（血友病甲），即因子Ⅷ促凝成分（Ⅷ：C）缺 乏症，也称AGH缺乏症，是一种性联隐性遗传疾病，女性 传递，男性发病。 • 血友病B（血友病乙），即因子Ⅸ缺乏症，又称PTC缺乏 症、凝血活酶成分缺乏症，亦为性联隐性遗传，其发病数 量较血友病A少。但本型中有出血症状的女性传递者比血 友病A多见。 • 血友病C（血友病丙），即因子Ⅺ（FⅪ）缺乏症，又称 PTA缺乏症、凝血活酶前质缺乏症。为常染色体不完全隐 性遗传，男女均可患病，是一种罕见的血友病。 15～20/10万男孩中有发病，此发病率在所调查的不 同的种族和地域之间没有差异。发病率以血友病A最多占 85%，血友病B占15%，血友病C较少见。
• 基因修正（gene correction）
指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留 正常部分。
2.1.1.2 基因替代
• 基因替代（gene replacement）
指通过同源重组（基因打靶）技术，将正 常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替 换致病基因。（不涉及基因组整体改变的情况 下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想 的治疗方式。）
• 指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒 素基因与一些特异受体的配体基因融合， 构建融合基因，导入高度表达该受体的肿 瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。
PE DT
2.2 基因治疗的种类
• 基因导入的方式 1. ex vivo 途径
2. in vivo 途径
•
按靶细胞
1. 生殖细胞基因治疗 2. 体细胞基因治疗
2.1.2 间接策略
导入与致病基因无直接联系的治疗基因
• 免疫基因治疗 • 分子化疗 • 特异性细胞杀伤
2.1.2.1 免疫基因治疗
• 将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人 体内，改变病人免疫状态，达到预防和治 疗疾病的目的。
1. 细胞因子基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、 INF-γ、TNF-α、G-CSF、GM-CSF 2. 免疫增强基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子 3. 肿瘤DNA疫苗疗法 癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗
基因打靶
2.1.1.3 基因增强
• 基因增强（gene augmentation）
又称基因修饰，是指不去除异常基因，将有 功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生 非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功 能，或使原有的功能得以加强。 目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型 纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以 表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形 成。
内容
基因缺陷病
基因治疗
基因治疗的应用
2 基因治疗
• 基因治疗（gene therapy）是指将外源正常 基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺 陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。
• 狭义的基因治疗是指用完整的基因进行基 因替代治疗，而广义的基因治疗还包括利 用基因药物或核酸药物的治疗。
2.1 基因治疗的策略
1.3.1 先天性心脏病
心房间隔缺损（ASD）
心室间隔缺损（VSD）
法洛四联症
1.3.2 基因缺陷病
先天性幽门狭窄 先天性髋脱臼
先天性巨结肠症
1.4 治疗方法
• 1. 2. 3. 4.
•Байду номын сангаас
传统治疗方法 药物治疗 手术治疗 放射治疗 理疗
新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy)
基因缺陷病 的产前诊断
将基因载体注入血液，定向寻找靶细胞并将基因 安全有效地导入。
2.2.2 靶细胞类型
• 生殖细胞基因治疗(germ cell gene therapy)
以生殖细胞为对象的基因治疗称为生殖细胞基 因治疗，广义的生殖细胞基因治疗以精子、卵子 和早期胚胎细胞作为治疗对象。
• 体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)
2. 腺病毒（AV)
3. 腺相关病毒（AAV) 4. 单纯疱疹病毒（HSV) 5. 痘苗病毒（VV)
• 非病毒载体： 1. 脂质体法 2. 直接注射法 3. 受体介导基因转移 4. DNA-磷酸钙共沉淀 5. 电穿孔
3.2.2.1 逆转录病毒
5’LTR
gag pol env 3’LTR
• 结构基因 1. gag (group antigen) ：编码核心蛋白和属特异 性抗原 2. pol (polymerase) ：编码逆转录酶 3. env (envelop) ：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白 • LTR 调控序列
2.1.1.4.1 抑癌基因疗法
• 抑癌基因：
是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿 瘤生的一类基因群。 Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因
2.1.1.4.2 反义核酸技术
• 反义RNA（antisense RNA）
与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。
• 核酶（ribozyme）
抗 维 生 素 佝 偻 病
D
1.1.4 X连锁隐性遗传病
• X连锁隐性遗传病传男 不传女，往往母亲是 携带者儿子为患者。
血友病A
1.1.5 Y连锁遗传病
• Y连锁遗传病的特点是父亲传递给儿子，女儿不 发病。因Y染色体上主要有男性决定因子方面的 基因，其他基因很少，故Y连锁遗传病极少见。
毛耳性状
1.2 单基因遗传病
基因增强奥运
2.1.1.4 基因干预
• 基因干预（gene interference）
是采用特定的方法，导入外源基因选择性地 阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、 RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。 1. 导入抑癌基因 2. 反义核酸技术 (antisense technology)： ①反义RNA；②反基因技术；③核酶 3. RNA干扰（RNA interference)
具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后 能发挥酶活性，将mRNA降解。
• 反义脱氧寡核苷酸，ODN
核酶
2.1.1.4.3 RNA干扰
• 概念：短的双链RNA (dsRNA) 导入细胞， 可以使同源mRNA发 生特异性的降解，从 而阻断相应基因的表 达。 • 特点 1. 高度的序列专一性 2. 高效性 3. 易操作性
治疗将遗传物质引入人的体细胞进行基因治 疗的方法称为体细胞基因治疗。
3.2 基因治疗的基本程序
1. 2. 3. 4. 5. 外源基因的选择与制备 载体的选择与构建 靶细胞的选择 基因转移 基因转染细胞的筛选与鉴定
6. 回输体内
3.2.1 外源基因的选择与制备
• 外源基因 目的基因：
与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因
2.1.2.2.3 药物增敏基因治疗
• 将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药 物的敏感性。 • 如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细 胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细 胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使 癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。
2.1.2.3 特异性细胞杀伤
2.2.1 基因导入方式
• 直接体内疗法（in vivo）
是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官， 使其进入相应的细胞并进行表达。
• 间接体内疗法（ex vivo）
是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛 选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内 有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。
2.2.1.1 直接体内疗法
1.2.3结构蛋白缺陷病——EhlersDanlos综合症
• COL5A1基因的22号内含子发 生剪切突变
1.2.4 受体蛋白病——家族性高胆固醇血症
• 家族性高胆固醇血症是低密度脂蛋白（ＬＤＬ） 受体基因突变所致的常染色体显性遗传性疾病， 目前已发现的ＬＤＬ受体基因突变达１５０多个。
黄色瘤
角膜弓
标记基因:
新霉素磷酸转移酶（Neo）基因
• 外源基因的获得
基因克隆 人工合成 PCR扩增
外源基因选择规则
3.2.2 载体的选择与构建
• 目前用于基因治疗的载体可分为病毒载体（利用 治病基因取代天然病毒某些基因）和非病毒载体 （基于DNA的人工复合物或微粒）两种。
• 病毒载体：
1. 逆转录病毒（RV)
多指
并指
原发性青光眼
1.1.2 常染色体隐性遗传病
• 常染色体隐性遗传病要有两个等位致病基因才会 发病，患儿的父母往往都是致病基因携带者，凡 是代谢性遗传病均属于常染色体隐性遗传病。
苯 丙 酮 尿 症
1.1.3 X连锁显性遗传病
• X连锁显性遗传病的致 病基因位于X染色体上， 男性只有一条X染色体， 表现症状较重，女性 有两条X染色体表现症 状较轻，但女性受累 者是男性的两倍。
↓
药物复合物 有毒
细胞死亡
自杀基因
2.1.2.2.2 化疗保护性基因治疗
• 指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细
胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。
• 如将多药抗性（multiple drug resistance, MDR）基 因 MDR-1 导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制
的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。