宏基因组技术在微生物中的应用

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❖ 另一类是间接提取法,即异位提取法,是利用离心介 质或者梯度离心等方法先把微生物从环境样品中分 离出来,再按处理纯培养细胞的方法裂解微生物细胞 提取DNA。
❖ 该法获得的宏基因组DNA受到胞外杂质污染干扰较 少,纯度较高、DNA完整性好(20kb~500kb),适合构 建大片段的宏基因组文库。但该法操作较繁琐、费 时、成本高、偏差大、DNA得率较低,其产率只是直 接裂解法的1%~10%,且获得的DNA往往不能完全代 表样品所在生境的生态学多样性。
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2.4宏基因组文库的构建 载体的选择
❖ 载体选择在宏基因组技术中占有十分重要的 地位。载体系统的选择主要依赖于DNA提取 质量、插入片段、质粒拷贝数、宿主菌及筛 选方法。根据克隆载体的不同宏基因组文库 可分为质粒文库、细菌/酵母人工染色体文库、 噬菌体类载体文库。
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❖ 早期宏基因组文库主要以质粒载体和大肠杆菌宿主 细胞构建而成的小片段(<15kb)文库。该文库操作简 便、拷贝数高、对DNA质量要求不高,适合纯度低或 剪切较严重的DNA模版。但插入片段小,筛选量大, 活性比率低,对大基因簇无能为力,主要适用于分析 新的基因序列信息及筛选编码代谢相关的单一基因 或小操纵子。然而,很多微生物活性物质是其次生代 谢产物,代谢途径由多基因簇调控,因此尽量插入大 片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必 要的。
❖ 其前端关键性技术是环境DNA(environmental DNA,eDNA)的提取,eDNA提取方法的精确程度将直 接决定文库中微生物信息的精确度;下游关键性技术 是文库的分析与筛选技术。
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2.1环境样品及目的基因组富集
❖ 在宏基因组文库筛选过程中目的基因仅占总 DNA的一小部分,对环境样品的预富集可以大 大提高目的基因的检出几率。目前预富集技 术主要分为细胞水平富集和基因组水平富集。
宏基因组技术在 微生物中的应用
蒋超 4031031182
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❖ 1.宏基因组概述 ❖ 2.环境宏基因组学基本技术 ❖ 3.环境宏基因组学技术的主要瓶颈
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1.宏基因组概述
1.1.微生物资源开发应用的新途径
❖ 据估计每克土壤样品中可含有高达4,000种的不同微生物， 1g土壤就包含6. 1×107个基因。
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❖ 细胞水平富集主要是通过利用选择培养基对 目的微生物进行富集培养,最常用的方法是底 物选择,此外还包括营养选择及物理化学指标 选择。但是由于富集培养选择性地富集了具 有快速生长特性的菌群,因此导致大部分物种 多样性信息丢失。目前可以通过先在严格胁 迫条件下短期处理,然后改为较温和的处理条 件,可以从一定程度上克服这种方法的局限性。
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❖ 新途径—宏基因组途径
近年来发展起来的宏基因组克隆技术,直接提 取环境样品核酸进行遗传操作,避开了微生物 分离培养问题,极大地扩展了微生物资源的利 用空间。已在土壤生态环境、海洋生态环境 和各种极端环境中开展应用。
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1.2.宏基因组定义
❖ “1998年Handelsman等首次提出宏基因组的 概念。一种以环境样品中的微生物群体基因 组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为 研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化 关系、功能活性、相互协作关系、及与环境 之间的关系为研究目的的新的微生物研究方 法。
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2.3宏基因组DNA的提取
❖ 获得高浓度、大片段、无偏好的环境样品总 DNA是宏基因组文库构建的难点之一。
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❖ 近年已有多种宏基因组DNA的提取纯化方法陆续建立起来, 大体可分为两类:一类是直接提取法,又称原位提取法。这类 方法不经过样品中微生物的培养和分离,通过化学法、酶解法 或物理法直接破碎环境中的微生物细胞而使DNA得以释放, 并对DNA进行纯化。
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❖ 基因组水平富集常用的技术为稳定同位素探针技术 (SIP),原理是采用稳定同位素标记底物,其中的“重” 原子掺入到具有代谢活性的微生物核酸中,采用密度 梯度离心的方法将“重”的DNA与“轻”组分分离, 被标记的“重”核酸可以作为PCR的模板,用来构建 宏基因组文库。此外,还有报道利用抑制性消减杂交 技术、差异显示技术、噬菌体展示技术、亲和捕获 技术及DNA微阵技术等技术来富集目的基因。
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❖ 宏基因组文库既包括了可培养的,又包括了未培养的 微生物遗传信息,因此增加了获得新生物活性物质的 机会。
❖ 采用构建宏基因组文库的策略筛选新的基因资源及 其表达活性产物的一般流程可以归纳为:样品和基因 (组)的富集;提取特定环境中的基因组DNA或mRNA; 构建宏基因组DNA或cDNA文库;筛选目的基因;目的 基因活性产物表达。
❖ 传统途径—培养途径
开发环境微生物基因资源较为传统的研究途径是:分离微生物, 获得纯培养,基因表达产物活性检测、活性物质的分离纯化直 至开发利用。这一途径被证明是十分有效的,也获得了诸多有 应用价值的活性物质。但是,环境中仅有0. 1% ~1%的微生物 能够采用现有培养技术进行分离培养,在今天采用传统培养方 法已很难发现新的活性物质,极大地限制了未培养微生物基因 资源的开发利用。
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图2
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2.环境宏基因组学基本技术
❖ 环境宏基因组学研究的基本思路是直接提取环境中 所有微生物的基因组DNA,克隆到合适的载体,通过 构建宏基因组文库,将环境中全部微生物的核酸信息 收集在一起,运用序列筛选或功能筛选方式从文库中 获得有用的酶、抗生素等生物活性物质及相关基因。
❖ 该法操作简便、省时、成本低,所获得DNA具有较好的完整 性,并能够代表某一生境的微生物群落多样性。但常会出现细 胞裂解不完全或DNA与土壤杂质成分产生共沉淀而无法有效 地去除等问题,所以一般需要进一步的DNA纯化处理,同时所 提取获得的DNA片段较小(1kb~50kb),主要适用于小片段文 库的构建。
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2.2.环境宏基因组文库筛选技术
❖ 环境宏基因组文库的筛选策略主要分为序列 筛选和功能筛选2种。序列筛选策略是先从文 库中获得目的基因,继而对之异源表达,得到具 有生物活性的产物;功能筛选策略则是先获得 具有生物活性的阳性克隆子,再通过插入片段 测序,得到相应的基因结构。2种分析策略对 于充分利用宏基因文库资源都是必要的。