发酵法产琥珀酸

发酵法产琥珀酸

琥珀酸,学名丁二酸,广泛存在于动植物和微生物体内,是生物进行TCA循环的中间产物之一。它是一种重要的有机合成中间体,主要应用于食品、医药、生物降解塑料、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂和动植物生长刺激物等领域。人们主要是利用化学合成的方法,从丁烷通过顺式丁烯二酐生产琥珀酸。该方法以石油为原料,生产成本高,环境污染严重,从而限制了琥珀酸的广泛应用。因此,人们开始将目标转向通过生物发酵法来生产琥珀酸。微生物发酵生产琥珀酸以可再生资源糖和二氧化碳等作为主要原料,不仅摆脱了对石油化工原料的依赖,而且可以固定二氧化碳,减少温室气体,绿色环保,具有一定的环境效益。在众多的琥珀酸生产菌中，目前研究最多的是琥珀酸放线杆菌( Actinobacillus succinogenes ) , 产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens) , 产琥珀酸厌氧螺(Anaerobiospirillum succiniciproducens) 和大肠杆菌( Escherichia coli)等。

产琥珀酸厌氧螺菌可自然产生高浓度琥珀酸, 但对高浓度葡萄糖和琥珀酸盐耐受性较差,而且要求严格厌氧环境,营养条件复杂,产物分离困难,生产成本较高,代谢途径尚未完全清楚,并且具有引起人类菌血症的潜在病毒性。产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼氏杆菌都属于瘤胃细菌,与其它测序基因组相比,二者的基因组序列更为相似,有很多共同的代谢特征:如能利用葡萄糖、果糖、木糖等多种碳源;以甲酸、乙酸和琥珀酸为主要发酵产物。产琥珀酸放线杆菌能耐受高浓度的琥珀酸盐和葡萄糖,是最具发展前景的琥珀酸生产菌之一,其突变株

系130Z的琥珀酸产量可达110g/L,是迄今报道的琥珀酸产量最高的菌株。但产琥珀酸放线杆菌对营养条件要求较高,并且只能在高CO2 浓度的条件下才以琥珀酸为主要产物,这需要额外的供气设备,增加生产成本。产琥珀酸曼氏杆菌虽然能以琥珀酸为主要发酵产物,但其琥珀酸产量和得率都相对较低,遗传学研究工具发展不成熟,有待于进一步提高。谷氨酸棒杆菌是工业谷氨酸生产菌,有望以纤维素糖为原料发酵生产琥珀酸,而且具有成熟的遗传学研究工具和丰富的背景知识,但对其产琥珀酸的研究起步较晚,一些有机酸产生途径尚未了解清楚,琥珀酸浓度和生产率都相对较低,产物分离纯化过程复杂,成本高。大肠杆菌是模式生物,可以产生微量的琥珀酸,但是培养条件相对简单,基

因组序列已完全公布,遗传背景和代谢途径比较清楚,菌种筛选和代谢途径改造比较容易,是研究琥珀酸代谢途径和提高琥珀酸产量的理想微生物。

产琥珀酸厌氧螺菌研究进展

产琥珀酸厌氧螺菌是一种革兰氏阴性严格厌氧菌，以葡萄糖、乳糖为碳源发酵主产物为琥珀酸和乙酸，同时生成少量的甲酸、乙醇、乳酸。产琥珀酸厌氧螺菌是通过EMP途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），再通过羧化途径最终生成琥珀酸。CO2浓度可以调节PEP羧化激酶的表达，CO2浓度上升，胞内PEP羧化激酶浓度上升CO2对琥珀酸发酵的影响与发酵液pH有关，通入H2有利于琥珀酸的生成，对其它副产物生成没有影响。产琥珀酸所用的CO2可以由Na2CO3(浓度1.5 M)提供，此时通入CO2对产琥珀酸有负作用，对副产物乙酸的产

生没有影响。

产琥珀酸放线杆菌研究进展

产琥珀酸放线杆菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧瘤胃细菌。产琥珀酸放线杆菌可以利用多种碳源，并且可以在高浓度的琥珀酸条件下生长。产琥珀酸放线杆菌与产琥珀酸厌氧螺菌的琥珀酸发酵代谢途经相同，是通过EMP途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），再通过羧化途径最终生成琥珀酸。密西根生物技术研究中心（MBI）的Guettler等人以Actinobacillus succinogenes130Z为出发菌株，筛选得到的自发突变株的琥珀酸产量可以达到80 g/LGuettler等人对筛选得到的自发突变株的发酵条件做了初步的研究，实验结果表明，该菌株可在高浓度的葡萄糖培养基中生长（150 g/L），酵母抽提物、玉米浆有利于菌体生长和产酸，O2对菌体无毒害作用，在空气中提高CO2分压有利于菌体生长和产酸，菌体的最适生长和产酸pH为6.8。

产琥珀酸大肠杆菌研究进展

厌氧条件下,大肠杆菌以糖或其衍生物为底物进行混合酸发酵,发酵产物为甲酸、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等,其中琥珀酸得率较低,一般低于0. 2mol /mol葡萄糖。大肠杆菌有两种葡萄糖消耗方式,一是葡萄糖经磷酸转移酶系统( PTS)转移和磷酸化,以磷酸烯醇式丙酮酸( PEP)为辅助底物, 1 mol葡萄糖转化生成1 mol PEP和1 mol丙酮酸;二是葡萄糖借助半乳糖协同运输系统的半乳糖渗透酶到达细胞体内,经葡萄糖激酶磷酸化进入糖酵解途径, 1 mol葡萄糖最终转化为2 mol PEP。PEP可以被PEP羧化酶和丙酮酸激酶利用, PEP羧化酶催化PEP

固定CO2 ,生成草酰乙酸进入C4途径,继而被后续的苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸还原酶转化为琥珀酸。

产琥珀酸曼氏杆菌研究进展

产琥珀酸曼氏杆菌是兼性厌氧革兰式阴性菌，在pH6.0-7.5时生长良好。厌氧发酵生产琥珀酸、乙酸、甲酸的比例为2:1:1。Lee等对此菌种的PEP羧激酶进行了克隆、测序和特性研究，并且在2004年对此菌株进行了全集应组测序以及基因组规模的代谢通量分析和代谢特

点研究。研究结果表明，此菌株非常适合CO2环境，以富马酸作为电子受体代谢，非常利于高产琥珀酸。

代谢工程改造

虽然大肠杆菌的琥珀酸产量不高，通常为12 mol/100 mol葡萄糖。但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌，它的基因组和蛋白质组的信息比较全，其代谢途径也比较清楚，用基因重组以及其他分子生物学手段来提高它的琥珀酸产量是可行的。

目前对大肠杆菌的改造研究可以归纳为如下结果：

1、以野生型大肠杆菌W1485为出发菌株Clark等人通过插入外源基因使编码丙酮酸甲酸裂解酶pfl和乳酸脱氢酶ldh的基因失活的方法构建了菌株NZN111，其基因型为NZN111(F-Apfl::Cam ldhA::Kan)。NZN111不能以葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖，果糖，甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成琥珀酸，乙酸和乙醇。这时底物的氧化还原水平就是决定产物生成比例的关键。对NZN111在含有卡那霉素的琼脂平板上培养并筛选到了自发突变株AFP111。AFP111能够发酵