植物基因枪法转基因技术

基因工程随堂作业

题目：植物基因枪法转基因技术

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植物基因枪法转基因技术

转基因技术是指将一个或更多的目的基因导入受体中,使该基因在受体生物中得以表达。随着植物基因工程技术的发展,20世纪80年代末,一项新的基因转化技术---基因枪技术应运而生。由于基因枪技术安全性好、效率高,其应用范围迅速从植物基因工程、动物基因工程扩大到基因治疗和基因免疫领域,使细胞的研究发展到在体操作。目前,已有基于基因枪技术的多种基因疫苗进入临床研究阶段。

1.基因枪技术的转化原理及操作

用包裹DNA的金属小颗粒轰击受体组织,使DNA实现穿壁并被导入众多细胞中,称为“基因枪法”(或微粒轰击技术)。包裹着DNA的金属粒加速到一个很高的速度后(通常需要部分真空以减少颗粒的速度损失)穿透受体组织,一般可以穿透2,3层细胞。最初是利用爆炸力在枪管里推动一个大的塑料微粒载片,片上放有包裹着DNA的微粒悬液,后来用一个中间有洞的板挡住高速运动的载片,载片上的微粒穿过洞进入装有受体组织的真空腔中,并且打入或者穿过运动路径上的目标组织,微粒上携带的外源DNA分子就可能进入细胞,并进行表达。基因枪根据驱动力可以分为3种基本类型。

(1)火药式基因枪是最原始的类型,由美国康乃尔大学Sanford等人于1987设计制造。这种基因枪自使用以来已先后将外源基因导入到玉米、小麦和水稻等多种植物材料中,获得了瞬间的或稳定的表达。它的主体由滑膛腔、真空轰击室和阻弹部件构成。塑料子弹的前端载有大量携带了外源目的基因的微弹,当样品爆炸时,子弹带着微弹向下高速运动,至阻挡板时子弹被阻碍,其前端的微弹依靠惯性继续高速运动,击中轰击室的靶细胞。该装置的特点是,粒子速度主要通过货样的数量及速度调节器控制,不能无级调控,可控程度低。

(2)压缩气体型基因枪的动力系统以氦气、氮气和二氧化碳气驱动。一种方法是把载有外源目的基因的微弹悬滴在一张金属筛网上,在高压气体的冲击下,射入受体靶细胞;另一种方法是把外源目的基因与微弹混合后雾化,再由高压气体驱动射入受体靶细胞,这种系统的靶范围可精确控制到0。15mm左右。

(3)高压放电型基因枪利用电加速器通过高压放电将微弹射入受体靶细胞,其特点是可无级调控,通过调节放电电压来控制粒子的速度和入射速度。

2.基因枪技术的应用

最早应用基因枪进行基因转化并获得成功的是Klein等人,他们用基因枪转化洋葱表皮的细胞,并获得了成功。后来McCabe将目的基因包于钨粉上,电轰击大豆茎尖分生组织,结果约有2j的组织通过器官发生途径获得再生植株,在子代中检测到了外源基因。1989年用气动式基因枪转化烟草等植物获得成功,且得到了瞬时表达。大麦的转基因技术与其他植物相比发展较慢,Kartha等用大麦的细胞和组织进行培养,检测到报告基因的瞬时表达。基因枪技术还在禾谷类作物中得到广泛应用,克服了单子叶植物的遗传转化受农杆菌寄主限制的局限性。Gordon Kamm等用基因枪技术将GUS报告基因和PAT选择性基因导入基因型为A188iB73的玉米胚性悬浮细胞系,首次获得转基因玉米的可育植株,使转基因玉米技术

受到很大的关注。贾柿荣等用国产火药式基因枪实现了质粒pBH21对玉米花粉的转化,经人工授粉,获得了转基因植株。

基因枪法不仅可用于直接轰击悬浮细胞系和花粉,还可以用来轰击单个细胞。Rasmussen等利用氦动基因枪,用含质粒pBC-17或PBAR-GUS的完整大肠杆菌DH5-和含质粒pNY的根瘤农杆菌A208轰击玉米细胞,获得数个瞬间转化体,其中有6个是稳定的。基因枪技术在对水稻进行基因转化的应用中也获得了成功。Oard首先应用该技术获得了转基因水稻的愈伤组织,检测到了GUS基因的瞬时表达。同年,

Cao用基因枪技术转化水稻成熟胚,成功获得了转基因水稻植株。小麦是栽培面积最大的重要粮食作物,但却是最后一个获得转化成功的禾谷类作物。Vasil等首次报道用基因枪技术将GUS基因和Bar基因转入长期培养的小麦胚性愈伤组织中。

3.基因枪技术的优缺点

3.1基因枪技术的优点是:

(1)无宿主限制,能转化任何植物,特别是那些由原生质体再生植株较为困难和农杆菌感染不敏感的单子叶植物,提高了禾谷类植物的转化效率。

(2)靶受体类型广泛,不受基因型的限制,适用于不同的物种以及同一物种的不同品种,能转化植物的任何组织或细胞。

(3)可以转化线粒体、叶绿体等植物的不同细胞器。外源DNA进入细胞质后很难穿过双层膜在细胞器,用基因枪技术转化这类细胞器,转化频率高,重复性好,是目前该领域研究

中最常用和最有效的DNA导入技术。

(4)可以快速获得第一代种子,方法简便易行。基因枪转化法在无菌条件下用载有外源基因的金属颗粒

轰击受体材料,便可以进行筛选培养,不需要进行原生质体的制备分离与培养的繁琐

工作。

(5)可控程度高,采用高压放电或高压气体驱动,可根据实验需要,将金属颗粒(载体)

射入特定层次的细胞,提高了遗传转化的效率。

3.2基因枪技术的缺点是:

(1)基因枪轰击的随机性导致转化效率不高。

(2)基因插入往往是多拷贝随机整合到受体基因组中,可能发生多种方式的重排。

(3)同源序列能以DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA 的方式相互作用,导致转录或转录后水平的基因沉默。

(4)轰击过程中可能造成外源基因的断裂,使插入的基因成为无活性的片段。

(5)出现非转化体或嵌合体的可能性较高。

(6)应用成本较高。

4.基因枪转基因技术的发展前景

目前,作物基因工程正处于飞速发展时期,越来越多的转基因植物产品进入市场。人们可以利用基因枪技术转化培养特定农艺性状基因(如抗病、抗旱、抗寒、抗涝、抗虫、耐