第八章+基因诊断与治疗

• DNA ：反映基因的存在状态: 完整？突变？缺失？ • RNA：反映基因的表达状态
基因诊断的内容
1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病
2、单基因遗传性疾病，如苯丙酮尿症、无丙种球
蛋白血症
3、多基因疾病，如肿瘤、高血压
4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医
物证
• 二、基因诊断常用的分子生物学技术
(三)、单链构象多态性分析(single-strand comformation polymorphism analysis，SSCP)
• 一种简便检测核酸序列中点突变的技术。 • 原理 • DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。 • DNA单链的构象取决于序列。
• 产物变性后于中性胶中电泳，与正常对照比较，若电 泳行为异常，则认为内含突变的碱基。借此确定致病
• （二）、PCR：
• 可以对微量DNA进行分析和鉴定。灵敏度高、特异性 强、产率高、重复性好以及快速简便等不可替代的
优点，迅速成为成为基因诊断的主要和首选技术。
• 1．PCR技术的原理。PCR原理.ppt
• 主要为DNA的微量分析：是DNA微量分析的最好办法。
如一滴血液、一根毛发样品中少数细胞的DNA即可满足PCR检
基因诊断技术
点样
Probe-32P
检测
A
斑 点 杂 交
B 1 2 3 4
基因诊断技术
荧 光 原 位 杂 交
基因诊断技术
荧 光 原 位 杂 交
• 组织原位杂交(tissue in situ
hybridization) 简称为原位杂交。荧光原
位杂交(fluorescent in situ
hybridization，FISH)，用于基因定位研究
１、望、闻、问、切经验型诊断 ２、化验/检验—材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排
泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。
３、影像学—X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。 ４、特殊检查—染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。 在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作 用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高 和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。
四 套 反 应 体 系
1--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddATP 2--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddCTP 3--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddGTP 4--dATP, dCTP, dGTP, dTTP. + ddTTP
0.2kb
正常人 突变携带者 杂合子 患者 纯合子
+
目录
(六) DNA序列测定： 最直接、最准确的基因突变检测 方法。
目录
脱 氧 核 苷 酸 的 连 接
DNA测序
P
5 C 4
3 OH OH O 2 H 5 C 4 3 OH 1
碱基
P
O
2 H 1
碱基
P
5 C 4
3 O
O 2 H 5 C 4 3 OH 1
• 由于DNA分子突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失， 可使人类基因组DNA产生大量的中性突变。在人群中，
个体间DNA序列存在着差异性，称为DNA多态性。
• 其中一些突变发生在限制性核酸内切酶的识别位点上， 如果用相关的限制性核酸内切酶切割基因组DNA，就会 产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。
携带者。 • 2、采用分子杂交技术和聚合酶链反应技术具有信号放 大作用，灵敏度高。 • 3、在疾病尚无临床表现时作早期诊断，如产前诊断，
特定人群的大规模普查和筛检。
• 4、检测样品获取便利，一般不受组织或时相限制。 • 5、检测对象可为自体基因，也可为外源基因，适用于 多种疾病的诊断，应用范围广。
• 原理：检测DNA和RNA的结构、量、表达功能， 以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化，以 此作为疾病确诊的依据。
RLFP分析法
目录
五、限制酶酶谱分析：
基因突变导致基因上某一限制酶识别位点的改变
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)
5´ 1.15kb 3´
正常基因
×
5´ 1.35kb 3´
突变基因
目录
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
1.35kb
﹣
1.15kb
• （一〕、点突变的诊断 1、诊断已知的点突变：
采用PCR／ASOH(a1lele-specific oligonucleotide hybridization)，即等位基因特异性寡核苷酸杂交法检测。 等位基因特异寡核苷酸探针： 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡 核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸
• 5’
等位基因特异的寡核苷酸探针(ASO)检测点突变
正常探针 G A G 点杂交 异常探针 T A G 点杂交
正常人 DNA
患者 DNA 杂交结果
正常人 者 DNA
患 DNA 杂交结果
正常人 DNA
患者 DNA
正常人 者 DNA
患 DNA
正常探针 G A G
点杂交
异常探针 T A G
点杂交
正常人 DNA
Hetero
Homo
镰状细胞贫血： b珠蛋白基因点突变
bA probe bS probe ACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC GAG(Glu)-->GTG(Val) ACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC
bA probe bS probe Homo Hetero Normal
DNA芯片技术 DNA microarray (DNA chip)
增的可能性，使PCR实验结果的可靠性提高。
• (3)不对称PCR(asymmetric PCR)：
• (4)多重PCR(multiplex PCR)
☆ 多重PCR
在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区域不重叠 用于检测同一基因多个外显子的缺失
E1 E2 E3
• (5)等位基因特异性PCR(allelespecific PCR，AS-PCR)。 • (6)原位PCR(in situ PCR)
（突变探针〕，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸
（正常探针〕，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。
• PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突 变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO 探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时 间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。
in situ for gene diagnosis.ppt。
• 等位基因特异性寡核苷酸杂交法(allelespecific oligonucleotide hybridization，
ASOH) 。
寡核苷酸探针斑点印迹杂交分析法
主要适用于检测 已知点突变 受检者基因组DNA或含 突变位点的PCR扩增产物 与标记的ASO 探针杂交 ASO1 ASO2 Normal
基因。
TGCACCAGTA ACGTGGTCAT
TGCAC ACGTG
T G
AGTA TCAT
正常基因序列
突变基因序列
•用这项技术可以检测到70％到90％的点突变，但没 有电泳新生条带的出现并不能确认分析对象不存在
突变。
• SSCP的检测对象既可以是DNA分子，也可以 是RNA分子。这项技术往往跟在PCR之后应用，
因此合称为PCR-SSCP。由于SSCP的灵敏度随
检测序列的增长而降低，所以检测对象的长
度以不超过300个核苷酸为宜。
对照 实验
﹣
+
正常人
纯合突变
杂合突变
Leber 病患者 PCR/SSCP分析
(四)、DNA分子多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)
碱基
H2O
脱 氧 核 苷 酸 的 连 接
P
O
2 H 1
碱基
P
5 C 4
3
O 2 H 5 C 4 3 OH 1
碱基
双 脱 氧 核 苷 酸
?
…
X
P
H OH
O
2 H 1
碱基
3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’
ATGCGGTACCAT TA TACGCCA TACGCCATGGTA C C C
5’ 测序模板 第一套反应 第二套反应
患者 DNA
正常人 DNA
患者 DNA
• 2、诊断未知的点突变：
• PCR/SSCP/sequencing方法 PCR：扩增待测基因、野生型对照基因 SSCP：判断是否发生基因突变 DNA序列测定：确切的突变 DNA芯片技术
3、少数核苷酸的缺失和插入
采用PCR／ASOH(a1lele-specific oligonucleotide hybridization)
►由于基因诊断的发展时间还不长，人类对基因的了解
还有许多空白，因此许多疾病的诊断还主要依赖于传 统的方法，但随着分子遗传学、分子生物学，特别是 人类基因组计划的完成和基因功能定位进一步丰富， 基因诊断将显示出强大的生命力。
基因诊断的特点
• 1、直接检测导致疾病发生的特定基因变化，特异性强。
不仅可以对患病者作确诊，而且可以检测出致病基因的
（二）、大片段的缺失和插入
多重PCR
引物1
5 引物4 引物2
引物3
3
引物1和2：确定有无缺失及缺失片段的大小 引物3和4：确定缺失部位
(三）、基因重排
某Байду номын сангаас基因从一条染色体的正常位置转移到其他染色体的某个 位置称为基因易位或重排(gene translocation and
rearrangement)，这在肿瘤细胞中多为常见。已知重排基因
和重排位点的序列。
荧光原位杂交技术(FISH)可用来检测基因的染 色体定位。
利用PCR也可以检测基因重排，其前提是已知
测的需要。由于灵敏度高，易出现假阳性结果。
基因诊断技术
聚 合 酶 链 反 应
基因诊断技术
聚 合 酶 链 反 应
• 2．常用的PCR及其衍生技术
• (1)RT-PCR(reverse transcription-PCR)：用于mRNA的检测
和分析。cDNA clone.jpg
• (2)巢式PCR(nested PCR)：也称套式PCR，降低非特异产物连续扩
• （一）、核酸分子杂交
• 用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同 源核酸序列。检测正常基因或病变基因
• Southern印迹法(杂交)DNA
seperation.jpg，southern blot.jpg
• Northern印迹法(杂交)
Southern 印 迹 杂 交
基因诊断技术
Northern 印 迹 杂 交
A
C
G
T
A T G G T A C C G C A T
DNA自动测序
三、常见的基因异常及其检测
• 对于多数非感染性疾病而言，引起疾病发生的根本原因是基 因结构异常或者表达异常。
• 在DNA水平，基因结构异常包括点突变、插入、缺失、易位
和重排、拷贝数扩增、前病毒插入激活等形式。感染性疾病 的发生则是由于病原体侵入体内，表达外源性基因所致。 • 目前对这些基因结构或者表达异常都有相应的检测方法，主 要包括以下几个方面。
基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅 速的一类崭新的诊断技术，它依托分子生物
学技术，从基因型入手，诊断表现型。（逆
向诊断）
nucleus
transcription
Gene Diagnosis
translation
Biological Diagnosis Serum Diagnosis Clinical manifestation Clinical Diagnosis
Four types of diagnosis
一、基因诊断的基本概念
定义：
应用分子生物学技术 ,以DNA和RNA为诊
断材料，通过检查致病基因（内源或
外源）的存在、基因结构缺陷或表达
异常，对人体状态和疾病作出诊断的
方法和过程。
►基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状
细胞贫血病的产前基因诊断。
第八章 基因诊断与基因治疗
Gene Diagnosis and GeneTherapy
Ge Yin Lin, Ph D Professor
Department of Biochemistry and Molecular Biology, Medical College, Qingdao Uni.
传统的诊断（举例）：以疾病的表型改变为依据
这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测
也就是说“发病”了才能诊断。
•
随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越 多的证据表明，绝大多数疾病的发生和发展都与患 者的遗传物质结构和功能改变有关，所以遗传物质 的检查越来越显得必要。
• 人类绝大多数疾病都与基因密切有关,包括自身的 基因变异或外源基因的入侵。
第一节 基因诊断