万古霉素产生菌的分离及育种

2.基因组改组（基因组重排）
• 原生质体融合
选择诱变高产菌株为亲本进行基因组改组，各亲 本菌株制备原生质体，分别用紫外或加热灭活亲本原 生质体后等比例混合各亲本原生质体，用PEG作为融 合剂，室温下融合，Ｐ 液梯度稀释后再生，分离再生 改组菌落，测定各菌株活性筛选高产菌株．
3.后期筛选
• 突变菌株小量发酵 将突变菌株分别接种到液体培养基上，进行振荡 培养（摇瓶培养更接近发酵罐培养的条件，结果比较 一致，易于筛选到合适的菌株）。
８ ℃插片培养５～７ｄ，镜检。
• １６ＳｒＤＮＡ 鉴定 设计引物进行PCR扩增，纯化PCR产物并测序。序列 用NCBI blast,与GenBank相关序列比对分析。 • 结果见表1和表2
3.生物活性鉴定
• 采用抑菌圈法，分别以枯 草 芽 孢 杆 菌 和 金 黄
色 葡 萄 球 菌 为 指 示菌，测定分离菌株发酵液 抗菌活性．
根 据Kieser等 方 法修 改 ：冷 藏 菌 种 用 高 氏 一 号斜 面 活 化,28℃ 培 养，在培养过程中加入甘氨酸 （有利于溶菌酶渗透和增强细胞壁水解作用）进行预 处理。加入溶菌酶和溶壁酶水解放线菌细胞壁。
• ＸＭ０３０１原生质体诱变 参考Kieser 等方法修改：调整原生质体浓度，确 定合适的诱变剂量，加入NTG 诱变。采用离心法终 止诱变反应。 • 筛选高产菌株-浓度梯度法 用双层法制成浓度梯度平板，在高浓度区域长出 的菌落具备抗生素高产性能。最终从原生质体诱变再 生 平板上随机分离了10464个突变菌株 ．
• 高通量筛选模型-琼脂平板活性圈法 首先准备一块玻璃板，用含有枯草芽孢杆菌的琼 脂在玻璃框上制备平板，然后将含有相应的突变菌株 发酵液的牛津杯放置在琼脂平板上，培养。 最后测定各样品抑菌圈大小．通过比较各样品抑 菌圈大小，可以快速筛选出产量提高的高产突变菌 株．完整的筛选过程参见下图：
万古霉素产生菌育Hale Waihona Puke Baidu筛选流程图
结果 通过利用制霉菌素、重铬酸钾和万古霉素分别抑制真 菌、细菌和链霉菌等杂菌生长，高效地富集稀有放线菌，
从来自厦 门集美的 ２ 号土样中分离 出XM0301 ，在
高氏培养基上为草帽型放射状菌落，白色孢子。
2.菌株鉴定
• 观察菌丝形态、产孢结构和孢子形态 分离菌株形态特征于葡萄糖天冬酰胺琼脂、马铃 薯浸汁琼脂、高氏一号琼脂和 ＹＥＭＥ 培养基上 ２
基因组改组技术是结合经典诱变育种和原生质体融合技
术发展起来的一种育种新手段，在诱变产生遗传多质性的基 础上，通过多亲本原生质体融合，使带有不同基因位点正向 突变的数个亲本杂交，基因重组产生新的复合子，然后进行 筛选，最后获得具有多重正向进化标记的高效菌株．
1.原生质体诱变
• 发酵培养基初步调整
将XM0301菌种接种到不同发酵培养基，采用滤纸法 比较活性物质产量。结果表明，１号发酵培养基营养 丰富，发酵产物最高，而且 均匀无沉淀，便于大量突 变菌株产量比较和筛选，故后续育种实验中XM0301 均采用１号发酵培养基． • XM0301原生质体制备
通过利用菌株的形态特征、生理生化 特性和分子生物方法从土壤中分离万古霉 素产生菌，并采用育种技术选育具备工业 化潜力的万古霉素高产菌株，为进一步研
究奠定基础。
实验材料
1.万古霉素产生菌：东方拟无枝酸菌 ＸＭ０３０１由本实验 从厦门集美土样中分离． 2.指示菌：枯草芽孢杆菌和 金 黄 色 葡 萄 球 菌 购自中国医 学细菌保藏管理中心． 3.培养基枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌：ＬＢ培养基。拟 无枝酸菌分 离 培 养 基：高 氏 一 号 培 养 基（含有万古
综合培养、形态、生理和生化等特征，初步判
定筛选的 XM0301为 拟 无 枝 酸 菌 属，进 一 步
测 定 其 16SrDNA 序列［NCBI登录号为
DQ990889］，与无枝酸菌属相似性达 100％，比
对分析结果表明 XM0301为一株东方拟无枝酸菌。
4.产物鉴定
• 根 据 Ｄｉａｎａ等 方 法修 改 设计ＨＰＬＣ 条 件 ，以
一株万古霉素产生菌的分离及育种
文献来源：厦门大学学报 文献作者：王明兹、黄翠莲、吴莹莹
万古霉素的产生菌的选育
技术路线 实验内容
实验对象：一类稀有放线菌——拟无枝酸菌 基本原理： 运用分子育种中的基因组重排技术技术选育万古霉素高产菌 实验方法 得出结论
技术路线图
实验内容
研究背景
近年来，由于链霉菌中大量的抗生素不断被重复 发现，继而人们把研究的重点转向稀有放线菌(rare actinomycetes)。拟 无 枝 酸 菌属 （Amycolatopsis)就是一类非常重要的稀有放线菌，
产生万古霉素和利福霉素等重要临床药物，以及其他
抗菌、抗肿瘤等代谢产物。
万古 霉 素 （vancomycin）是 由 McCormick等 于1955年从一株东方拟无枝酸菌（A.orientalis）的
发酵液中分离得 到 的 一 种 糖 肽 类 抗 生 素。它能
够抑制革兰氏阳性菌的生长，而对厌氧菌和革兰氏阴 性菌无效。1958年 获 FDA批准上市.它 是 治 疗 耐 甲 氧 西 林 金 黄 色 葡 萄 球 菌（MRSA）和耐甲氧 西林表皮葡萄球菌（MRSE）等引起的严重或致命感 染的重要药物，对多重耐药性肠球菌感染性疾病也有 突出疗效.
Ｓｉｇｍａ公 司 盐 酸 万 古 霉 素 为标 样 分别采用保留
值法和内标法对XM0301发酵产物进行HPLC测定． • 通过 ＨＰＬＣ 分析，ＸＭ０３０１发酵液主要产物保留 时间为6.2min左右（图Ｂ），与万古霉素标准样品的保 留 时 间 一 样 （图Ａ）．进 一 步 采 用 内 标 法 比 较
霉素５０ｍｇ／Ｌ、重铬酸钾５０ｍｇ／Ｌ 和制霉菌素
５０ｍｇ／Ｌ），ＸＭ０３０１发酵培养基
实验步骤一 出发菌株获取
1.菌株的分离筛选
• 样品采集 土壤样品采自厦门海沧（１）和集美（２） • 富集培养 称取样品，加入无菌水，制成土壤悬浊液，梯度稀 释．分别取各个梯度稀释样品采用混菌法制成分离平 板，２８ ℃培养． • 分离筛选 挑取分离平板上的放线菌菌落，用划线法转接到新鲜 的无菌高氏平板，２８ ℃恒温箱培养，形成纯的单菌 落后再转接到新鲜高氏斜面培养保藏。
分析，在XM0301发酵液中添加万古霉素为内标后，
6.2min峰强度明显增强，其他各峰基本不变，XM0301的 主要产物为万古霉素，含量为860μ ｇ/mL（Ｂ、Ｃ）.
实验步骤二 获得高产菌株
通过育种技术提高万古霉素产生菌株的产量和产率，是 获得更大经济效益的另一途径．本文采取原生质体诱变和基 因组改组（基因组重排）技术选育万古霉素高产菌株。
选择原生质体诱变获得的７株万古霉素高产菌株作为基因
组改组亲本，进行两轮改组育种，结果约９０％以上菌株为 产量提高的正变菌株（见下表）
研究结果
• 利用稀有放线菌分离培养基高效地富集稀有放线 菌．并从采自集美的土样中分离了产万古霉素的东方 拟无枝酸菌，同时也有多株其他非链霉菌属放线菌。 对分离的 XM0301先进行原生质体诱变，然后通 过基因组改组，快速定向进化，最终获得万古霉素产 量达 到4210μ g/mL的菌株。第一轮基因组改组后随 机分离288个菌株，产量提高的占98.3％，60.8％菌 株量提高30％以上。第二轮基因组改组分离菌株产量 提高的占89.5％，产量提高30％以上的占2.8％，可 见进化效率较高，是快速筛选获得生产菌株的微生物 菌种选育新途径。
随着对链霉菌的广泛筛选，大量生物活性物质被
重复发现，从链霉菌得到新的生物活性物质的几率逐
渐 下降．因此，那些用常规方法较难分离到的稀有放 线菌逐渐被重视，获得这些新型菌株可避免对产生已 知生物活性物质的常见菌株的重复分离。稀有放线菌 的 分 离 成 为 获 取 新 抗 生 素 的 重 要 途 径 之一， 也是获得新种属和新物质的重要手段．
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谢 谢 观 看