目的基因片段与克隆载体质粒的连接操作步骤
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连接反应总体积为10μL,体系组成如下:
回收纯化的PCR扩增目的基因片段7.0μL 10×Ligation
buffer 1.0μL
T载体
(10ng/μL)
1.0μL
T4 DNA
ligase
1.0μL
共10.0ul
混均后,4℃连接18-24小时,连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。
转化操作方法
1)取一管-80℃保存的感受态细胞,置冰上融化;
一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例:
2)加入连接物(50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和),轻轻旋转离心管以混匀内容物,冰浴30min;
3)将离心管置于42℃热击60-90秒,然后迅速置冰浴2-3分钟,该过程不要摇动离心管;
4)向每个离心管中加入500ul液体LB培养基(不含抗生素),混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟(150转/分钟);目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达,使菌体复苏。
5)将离心管内容物混匀,吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上(含50 ug/ml氨苄青霉素),用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收,倒置平板,37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。
涂布用量可根据具体试验来调整:如转化的DNA总量较多,可取更少量转化产物涂布平板;反之,如转化的DNA总量较少,可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少,可通过离心
(4000rpm,2min)后析除部分培养液,悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。(涂布剩余的菌液可置于4℃保存,如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板)
注意事项:
1、感受态细胞应保存在-70℃,不可多次冻融和放置时间过长,以免降低感受态细胞的转化效率。
2、进行转化操作时,应根据相应温度及无菌条件的要求进行。
3、为防止转化试验不成功,可以保留部分连接反应液,以重新转化,将损失降到最低。
4、氨苄青霉素(Amp):使用前用无菌纯水配制母液,浓度为50mg/mL。