【CN109609427A】一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法【专利】
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( 19 )中华人民 共和国国家知识产权局
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910072760 .6
(22)申请日 2019 .01 .25
(71)申请人 中国科学院水生生物研究所 地址 430072 湖北省武汉市武昌区东湖南 路7号
(72)发明人 邱东茹 戴景程 周集中
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 江丽丽 王敏锋
2
CN 109609427 A
说 明 书
1/6 页
一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法
技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除基因ypjD的洛伊希瓦氏菌工程 菌及其构建方法，所述的工程菌可用于生产血红素。
背景技术 [0002] 血红素是含有二价铁离子的原卟啉IX，而原卟啉IX含有4个吡咯环结构，广泛的存 在于自然界中 ，从微生物到人体细胞中都含有该分子 ，它参与了很多生物过程 ，包括氧分子 的 转运和储存 (血红蛋白 和肌红蛋白) 、氧化磷酸化作 用中的电 子传递 (b-型细胞色素 和c型细胞色素) 、碳氢化合物的氧化作 用(细胞色素P450和细胞色素氧化酶) 。而在微生物中 ， 原卟啉 IX主要是细胞色素 、维生素B12及细菌叶 绿素等合成的 主要成分 ，进而参与菌体呼 吸、光合作用、气体转运、过氧化物的降解等重要生理活动。 [0003] 在应用方面，根据血红素的分子结构和物理化学性质，我们可以知道它具有重要 的生理功能和很高的使用价值。在医药领域，由于血红素中含有丰富的铁，易于被机体吸收 利 用，血红素铁有良 好的 促进骨髓造血 和治疗动物溶血性 和失血性贫血的 作 用，是人类迄 今所知的 最为理想的 抗贫血药物。在食品方面 ，由 于血红素是一类以 卟啉 环为结构的吡咯 类色素 ，血红素在溶液中呈红色 ，是一种天然色素 ，可以 作为肉 制品工业中的 着色剂 ，从而 逐步取代现在使用的亚硝酸盐及人工色素。在医药行业中，血红素还可用于制备抗癌药物。 在临床 ，血红素可 用作补铁剂 ，治疗缺铁性贫血症 ，易被人体直接吸收 ，可取代目前常 用的 其它补铁剂。 [0004] 目前市场上的血红素主要从动物血液中提取获得，有关血红素提取的国内的相关 企业有中韩合资浙江海宁和田龙生物科技有限公司和天津生命科学应用研究所等。近年 来 ，血红素越来越受到重视 ，人 们研究并提出了多 种提取方法。从目 前文献的 报道情况来 看，血红素提取方法主要有冰醋酸法、酸性丙酮法(酸钠法、蒸馏法、鞣酸法等)、羧甲基纤维 素(CMC)法和蛋白酶水解法等。每一种方法都有其优点，也有弊端。尽管提取的方法有所改 进，但要真正应用于生产需要考虑以下几个问题：一、降低成本。现有的方法成本高、产品单 一 ，没有做到联产其他产品 ；二、提取的过程中应尽量避免使 用毒性较大、难以回收的 有机 溶剂，做到环保生产。以往的方法普遍的不足是产品纯度低、提取成本高、生产周期长、溶剂 回收 难等。又由 于红血球的 血红蛋白中血红素与珠蛋白 相连 ，从血液中提取高纯度产品存 在一定难度。而目前有关实验室在微生物发酵的方法改进上也取得一些成效。众所周知，在 生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)开始的。 ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB)的催化下生成胆色素原，然 后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶 (HemD)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(HemE)和粪卟啉原 Ⅲ氧化酶 (HemF ；无氧条件下为HemN)的 脱羧氧化作 用生成原卟啉 原Ⅸ ，又在偶联呼吸 链辅 酶Q的 原卟啉 原氧化酶 (HemG) 催化下生成原卟啉Ⅸ。原卟啉Ⅸ在亚铁螯合酶 (HemH) 作 用下 将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。江南大学康振实验室将血红素的整个合成途径用质
菌及其构建方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种高产血红素的洛伊希瓦 氏菌基因工程菌及其构建方法，通过转座子随机 插入突变的方法获得一株深红色表型的洛伊希 瓦氏 菌（Shewanellaloihica）突变株 ，经基因鉴 定和遗传互补实验证实ypiD基因被插入突变失 活造成胞外红色物质的积累，经质谱鉴定该红色 物质为血红素，随后又利用同源重组的方法敲除 ypiD基因 ，从而得到高产血红素的洛伊希瓦氏 菌 工程菌PV-4△ypjD，该菌株可在胞外分泌大量血 红素 ，在摇瓶培养条件下 ，生物量（OD600）达到 2 .4-2 .6时，血红素产量为90-120mg/L，具有较大 的应用价值。
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/74(2006 .01) C12P 17/18(2006 .01) C12R 1/01(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109609427 A (43)申请公布日 2019.04.12
( 54 )发明 名称 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程
权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图5页
CN 10960942Baidu Nhomakorabea A
CN 109609427 A
权 利 要 求 书
1/1 页
1 .一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是将洛伊希 瓦氏菌(Shewanella loihica)PV-4的基因ypjD敲除后获得的，基因ypjD的核苷酸序列如 SEQ ID NO .1所示。
2 .权利要求1所述洛伊希瓦氏菌基因工程菌在生产血红素中的应用。 3 .权利要求1所述的高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，包括以下步 骤： (1)敲除洛伊希瓦氏菌染色体上编码具有限制性内切酶PstI和甲基化酶PstM活性的两 个基因，序列如SEQ ID NO .6和7所示，获得的菌株易于进行遗传操作； (2)将基因ypjD的上、下游片段通过cross-over PCR连接后，与自杀质粒相连，构建自 杀型敲除质粒p△ypjD； (3) 将含有自杀型敲除 质粒的 大肠杆菌营养缺陷菌株与步骤 (1) 获得的 洛伊希瓦氏 菌 接合 ，进一步筛选出发生双交换的 菌株 ，并经PCR扩增和测序证实框内缺失基因ypjD ，从而 获得基因ypjD敲除的洛伊希瓦氏菌工程菌。 4 .根据权利要求3所述的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的自 杀质粒为pDS3 .0，感受态细胞为大肠杆菌营养缺陷菌株E .coli WM3064。
( 12 )发明专利申请
(21)申请号 201910072760 .6
(22)申请日 2019 .01 .25
(71)申请人 中国科学院水生生物研究所 地址 430072 湖北省武汉市武昌区东湖南 路7号
(72)发明人 邱东茹 戴景程 周集中
(74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 江丽丽 王敏锋
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CN 109609427 A
说 明 书
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一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌及其构建方法
技术领域 [0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株敲除基因ypjD的洛伊希瓦氏菌工程 菌及其构建方法，所述的工程菌可用于生产血红素。
背景技术 [0002] 血红素是含有二价铁离子的原卟啉IX，而原卟啉IX含有4个吡咯环结构，广泛的存 在于自然界中 ，从微生物到人体细胞中都含有该分子 ，它参与了很多生物过程 ，包括氧分子 的 转运和储存 (血红蛋白 和肌红蛋白) 、氧化磷酸化作 用中的电 子传递 (b-型细胞色素 和c型细胞色素) 、碳氢化合物的氧化作 用(细胞色素P450和细胞色素氧化酶) 。而在微生物中 ， 原卟啉 IX主要是细胞色素 、维生素B12及细菌叶 绿素等合成的 主要成分 ，进而参与菌体呼 吸、光合作用、气体转运、过氧化物的降解等重要生理活动。 [0003] 在应用方面，根据血红素的分子结构和物理化学性质，我们可以知道它具有重要 的生理功能和很高的使用价值。在医药领域，由于血红素中含有丰富的铁，易于被机体吸收 利 用，血红素铁有良 好的 促进骨髓造血 和治疗动物溶血性 和失血性贫血的 作 用，是人类迄 今所知的 最为理想的 抗贫血药物。在食品方面 ，由 于血红素是一类以 卟啉 环为结构的吡咯 类色素 ，血红素在溶液中呈红色 ，是一种天然色素 ，可以 作为肉 制品工业中的 着色剂 ，从而 逐步取代现在使用的亚硝酸盐及人工色素。在医药行业中，血红素还可用于制备抗癌药物。 在临床 ，血红素可 用作补铁剂 ，治疗缺铁性贫血症 ，易被人体直接吸收 ，可取代目前常 用的 其它补铁剂。 [0004] 目前市场上的血红素主要从动物血液中提取获得，有关血红素提取的国内的相关 企业有中韩合资浙江海宁和田龙生物科技有限公司和天津生命科学应用研究所等。近年 来 ，血红素越来越受到重视 ，人 们研究并提出了多 种提取方法。从目 前文献的 报道情况来 看，血红素提取方法主要有冰醋酸法、酸性丙酮法(酸钠法、蒸馏法、鞣酸法等)、羧甲基纤维 素(CMC)法和蛋白酶水解法等。每一种方法都有其优点，也有弊端。尽管提取的方法有所改 进，但要真正应用于生产需要考虑以下几个问题：一、降低成本。现有的方法成本高、产品单 一 ，没有做到联产其他产品 ；二、提取的过程中应尽量避免使 用毒性较大、难以回收的 有机 溶剂，做到环保生产。以往的方法普遍的不足是产品纯度低、提取成本高、生产周期长、溶剂 回收 难等。又由 于红血球的 血红蛋白中血红素与珠蛋白 相连 ，从血液中提取高纯度产品存 在一定难度。而目前有关实验室在微生物发酵的方法改进上也取得一些成效。众所周知，在 生物体内，血红素的合成途径是从5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)开始的。 ALA是血红素合成途径的关键前体物质。ALA在ALA脱水酶(HemB)的催化下生成胆色素原，然 后胆色素原在羟甲基胆素合成酶(HemC)的作用下生成羟甲基胆素，又被尿卟啉原Ⅲ合成酶 (HemD)催化生成含有四吡咯环的尿卟啉原Ⅲ，再经过尿卟啉原Ⅲ脱羧酶(HemE)和粪卟啉原 Ⅲ氧化酶 (HemF ；无氧条件下为HemN)的 脱羧氧化作 用生成原卟啉 原Ⅸ ，又在偶联呼吸 链辅 酶Q的 原卟啉 原氧化酶 (HemG) 催化下生成原卟啉Ⅸ。原卟啉Ⅸ在亚铁螯合酶 (HemH) 作 用下 将铁离子螯合进原卟啉环生成血红素。江南大学康振实验室将血红素的整个合成途径用质
菌及其构建方法 ( 57 )摘要
本发明公开了一种高产血红素的洛伊希瓦 氏菌基因工程菌及其构建方法，通过转座子随机 插入突变的方法获得一株深红色表型的洛伊希 瓦氏 菌（Shewanellaloihica）突变株 ，经基因鉴 定和遗传互补实验证实ypiD基因被插入突变失 活造成胞外红色物质的积累，经质谱鉴定该红色 物质为血红素，随后又利用同源重组的方法敲除 ypiD基因 ，从而得到高产血红素的洛伊希瓦氏 菌 工程菌PV-4△ypjD，该菌株可在胞外分泌大量血 红素 ，在摇瓶培养条件下 ，生物量（OD600）达到 2 .4-2 .6时，血红素产量为90-120mg/L，具有较大 的应用价值。
(51)Int .Cl . C12N 1/21(2006 .01) C12N 15/74(2006 .01) C12P 17/18(2006 .01) C12R 1/01(2006 .01)
(10)申请公布号 CN 109609427 A (43)申请公布日 2019.04.12
( 54 )发明 名称 一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程
权利要求书1页 说明书6页 序列表5页 附图5页
CN 10960942Baidu Nhomakorabea A
CN 109609427 A
权 利 要 求 书
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1 .一株高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌，其特征在于，所述工程菌是将洛伊希 瓦氏菌(Shewanella loihica)PV-4的基因ypjD敲除后获得的，基因ypjD的核苷酸序列如 SEQ ID NO .1所示。
2 .权利要求1所述洛伊希瓦氏菌基因工程菌在生产血红素中的应用。 3 .权利要求1所述的高产血红素的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，包括以下步 骤： (1)敲除洛伊希瓦氏菌染色体上编码具有限制性内切酶PstI和甲基化酶PstM活性的两 个基因，序列如SEQ ID NO .6和7所示，获得的菌株易于进行遗传操作； (2)将基因ypjD的上、下游片段通过cross-over PCR连接后，与自杀质粒相连，构建自 杀型敲除质粒p△ypjD； (3) 将含有自杀型敲除 质粒的 大肠杆菌营养缺陷菌株与步骤 (1) 获得的 洛伊希瓦氏 菌 接合 ，进一步筛选出发生双交换的 菌株 ，并经PCR扩增和测序证实框内缺失基因ypjD ，从而 获得基因ypjD敲除的洛伊希瓦氏菌工程菌。 4 .根据权利要求3所述的洛伊希瓦氏菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述的自 杀质粒为pDS3 .0，感受态细胞为大肠杆菌营养缺陷菌株E .coli WM3064。