氯霉素ELISA检测试剂盒说明书

氯霉素（Chloramphenicol）ELISA检测试剂盒说明书

一、概要

氯霉素（chloramphenicol, CAP）是应用广泛的抗菌素，曾对畜禽疾病控制和治疗起到了重要作用。但由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血，粒细胞缺乏症等疾病，欧美等发达国家已相继禁止或严格禁止使用。

本试剂盒是应用ELISA技术研发的新一代药物残留检测产品，能最大限度地减少操作误差和工作强度。操作时间仅需1.5小时。

二、试验原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量。

三、适用范围

可定性、定量检测动物组织（肌肉、肝脏等）、尿液、血清、肠衣、牛奶、奶粉等样本中氯霉素的残留量。四、交叉反应率

氯霉素……………………………………100%；

琥珀氯霉素…………………………………92%；

氯霉素-葡萄糖苷酸………………………57%。

五、使用单位需自备的设备及试剂

设备：

┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm

┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置

┅┅均质器

┅┅振荡器

┅┅涡旋仪

┅┅离心机

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：100ml、500ml

┅┅玻璃试管：10ml

┅┅聚苯乙烯离心管：10ml、15ml、50ml

┅┅微量移液器：单道20μl～200μl、100μl～1000μl

多道250μl

试剂：

┅┅乙酸乙酯（分析纯）

┅┅乙腈（分析纯）

┅┅正己烷（分析纯）

┅┅二水合亚硝基铁氰化钠（分析纯）（供奶样用）┅┅七水合硫酸锌（分析纯）（供奶样用）

┅┅葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)（供尿样本用）

┅┅醋酸钠（分析纯）（供尿样本用）

┅┅肝素钠（分析纯）（供血样本用）

┅┅醋酸（分析纯）（供尿样本用）

----去离子水

六、提供的材料与试剂

1、96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）

2、标准液×6瓶：（2ml/瓶）

0ppb,0.025ppb,0.075ppb,0.225ppb,0.675ppb,2.025ppb

3、高浓度标准品：（2ml/瓶）100ppb

4、酶标二抗…………………………7m l

5、抗体工作液…………………………7m l

6、底物液A液…………………………7m l

7、底物液B液……………………………7ml

8、终止液……………………………7m l

9、20×浓缩洗涤液………………………40m l

10、2×浓缩复溶液………………50m l

七、溶液的配制

配液1: C液（供奶样专用）

0.36M 二水合亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液

称取10.7g二水合亚硝基铁氰化钠加去离子水溶解定容至100ml。

配液2: D液（供奶样专用）

1M七水合硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液

称取28.8g七水合硫酸锌加去离子水溶解定容至100ml 。

配液3: pH4.8 100mM醋酸钠溶液（供尿样本用）

称取2.4g醋酸钠，加入1.2ml 醋酸，再加去离子水溶解定容至500ml

配液4:乙腈-水溶液

量取84ml无水乙腈加入到16ml去离子水中混匀

配液5: 复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行

稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提

取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一

个月。

配液6: 洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子

水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境

可保存一个月。

八、样本前处理步骤

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

（c）处理样本的同时，做空白试剂对照，样本的测定结果减去空白试剂的测定结果为样本中氯霉

素的实际残留量。

组织样本空白对照试剂的制备

┅┅取4ml乙酸乙酯在氮气流下完全干燥；

┅┅用1ml正己烷充分溶解；

┅┅加入1ml复溶液工作液（见配液5），强烈振荡1min，静置分层后去除上层正己烷相；

┅┅取100μl水相用于分析。

（d）未处理的样本冷冻保存。

（e）处理后的样本可在2-8℃避光保存24h。未加正己烷之前，吹干的样本保存效果更好。

（f）处理后的样本，如出现乳化现象，可在去除部分上层有机相，60℃水浴5～10min消除乳化

后，再重复离心步骤。

（一）组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)前处理方法

┅┅用均质器均质组织样本；

┅┅称取3.0±0.05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入6ml乙酸乙酯，用振荡器振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；

┅┅移取4ml上层有机相（约相当于2g的样本）至10ml 干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入1ml正己烷，用涡旋仪涡动30s，再加1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动1min，3000g以上，室温（20-25℃）离心15min；

┅┅除去上层有机相，取下层100ull用于分析。

注：在检测动物肝脏样品时, 加入1ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml复溶工作液后，只需振荡10s，离心后取下层即可分析；在检测高脂肪样本时正己烷用量可加大2ml－3ml。

（二）鸡血前处理方法

┅┅用加有肝素钠（20-30单位/ml血）的离心管采集鸡血样本（建议采血注射器也用肝素钠润洗），血样本室温静置

1h，待析出血浆后，3000g以上，15℃离心10min；┅┅取1ml血浆至10ml聚苯乙烯离心管中，加2ml乙酸乙酯振荡1min；

┅┅室温（20-25℃）下静置待水相与有机相完全分层或

3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；

┅┅移取上层的有机相至15ml干净的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；

┅┅干燥的残留物加入1ml复溶工作液（见配液5），用涡旋仪涡动2min溶解干燥的残留物；

┅┅取100μl用于分析。

（三）尿液前处理方法

┅┅将尿液于3000g以上，室温（20-25℃）离心5min，直至尿液样本清亮；

┅┅移取2ml清亮尿液样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加0.5ml pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液（见配液3）混合；

┅┅加40μl葡萄糖苷酸酶(Merck,Art.No.4114)至稀释的尿液样本中，置37℃水解至少2h（或过夜），取出室温（20-25℃）放置；

┅┅该溶液恢复至室温（20-25℃）后加入8ml乙酸乙酯混合1min；

┅┅3000g以上，室温（20-25℃）离心10min，取出4ml 上层液体至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；

┅┅加入1ml复溶工作液（见配液5），涡动2min溶解干燥的残留物；

┅┅取100μl 用于分析。

（四）肠衣前处理方法

┅┅用均质器均质样本

注：干样本需剪碎（长度不超5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂洗20min以上(去除表面的盐份)，沥干后再进行均质；

┅┅称取1.0±0.05 g均质后的样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入10ml乙酸乙酯，振荡10min，3000g以上，室温（20-25℃）离心10min；

┅┅取出5ml上层有机相（相当于0.5g的样本）至10ml 干

净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；┅┅加入1 ml正己烷，涡动30s，再加0.5ml复溶工作液（见配液5）强烈振荡1min，3000g以上，室温（20-25℃）离心5min；

┅┅除去上层有机相，取下层100 μl用于分析。

（五）牛奶和奶粉前处理方法

（a）牛奶前处理方法

┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；

┅┅取5ml去除脂肪牛奶样本至10ml聚苯乙烯离心管中，加入150μl C液（见配液1）出现沉淀，振荡15s，再加入150μl D液（见配液2），振荡1min充分混合；┅┅3000g以上，15℃离心10min，移取上层液；