福林酚法

Folin酚法测定蛋白酶活力

(2009-06-16 18:03:47)

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生物

蛋白酶活力测定

folin酚法

原理

杂谈

分类：专业学习

一、原理

采用福林-酚试剂法。福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。

二、试剂

1) 福林-酚试剂

向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na

2WO

2

•2H

2

O)、25g钼酸钠及700mL

的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以小火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴液溴，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。

2) 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液

精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。

3) 0.4mo1/L碳酸钠溶液

精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。

4) pH值3～6醋酸缓冲液

精确取NaAc•3H

O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定

2

容至1000mL。

5) 2%酪蛋白底物缓冲液

a) 测试酸性蛋白酶缓冲液

精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。当日配用或置于冰箱中保存。

b) 测试中性蛋白酶缓冲液

精确称取酪蛋白20g，置于1000mL三角瓶中,加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)610mL，在沸水浴中搅拌使其溶解，冷却后过滤，加入0.2mol/L Na2HPO4溶液(去离子水配制)390mL，用去离子水定容至1000mL，即成pH7.0、2%酪蛋白溶液。当天配用或置于冰箱中保存。

6) 100μg/mL酪氨酸溶液

精确称取100mg酪氨酸，逐步加入0.lmol/L盐酸溶解后，用去离于水定容至100mL放入冰箱中保存，临用时用去离子水稀释10倍。

三、操作步骤

1. 酪氨酸标准曲线的绘制

取18支试管分成6组(每组3支，平行样)，编号，按表1分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4mol/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定(波长660nm)，以浓度为0μg/mL酪氨酸溶液做空白对照。

2. 样品酶活的测定

酶液适当稀释。取4支试管编号(1号为空白对照)，分别加入酶液1mL,1号管立即加入0.4mol/L TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入lmL pH 7.0、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液(如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液)，迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入

0.4mol/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L 碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定(波长660nm)。对照标准曲线，计算酪氨酸含量。

四、蛋白酶活力计算

蛋白酶活性定义:在一定pH值(pH3.6或7.0)和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。

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