大鼠肾小球系膜细胞培养

包曼囊 的小 球不 贴壁） ，很少见小 管上皮混杂。 台盼蓝染 色 ９ 以上小球 不着 色，活力 ５ 佳 。 原 代 培 养 的 小 球 ４ 多 贴 壁 ，细 胞渐 从 肾小 球 爬 出。 最初 长 出 的 细 胞 呈 卵 圆 —６ｄ大
形 ， 排 列 呈 铺 路 石 状 ， 主 要 为 上 皮 细胞 。 口周 左 右 上 皮 细 胞 渐 死 亡 消 失， 代 之 以外 形 星 状 、 梭 形 或树 枝 状 胞 浆 多 突 起 的 Ｍｓ Ｇ。 至 ２ ￣３ ， 上 皮 细 胞 完 垒 消 失 ， Ｍ日 渐 长 １ ０ ｄ时 Ｏ 成 融 合状 。 传 代 后 Ｍ日 Ｏ一 般 于 ７ —８ｈ 贴 壁， —３ｄ更 换 培 养 液 一 次 ，一 周左 右 细 胞 即可 ２
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３期
大 鼠 肾 小 球 系 膜 细 胞 培 养
好 进 行 肾脏 原 位灌 洗 。 肾小 球 分 离 中筛 网孔 径 的 大小 最 关 键 ， 孔 径 的 选择 依 据 所分 小 球 种 属 不 同而 异 。 谌 贻 璞 等【 曾用 ｉ ０ ｍ 孔 径 的不 锈 钢 筛 网 作 第一 道 ， 使 剁 碎 的 大 鼠肾皮 质 通 过 后 再 经 过 ０
Ｍｓ Ｇ。
这 里 需 提 厦 的是 ， 国 内 目前 Ｍｓ 培 养 方 法 中 多不 作 肾 小 球 原 位灌 洗 。 由 于 肾 小 球 Ｇ 中 大量 血 细胞 、 体成 分 ， 别 是 白 细 胞 及 红 纽 胞 碎 屑 对 细 胞 的生 长 均 具 有 抑 制 作用 。而 补 特
一
些 血 细 胞 （ 巨噬 细 胞） 存在 也 不 利 于 Ｍｓ 的 纯 化。 因 此 们 认为 肾 小 球 分 离 前 最 如 的 Ｏ 我
掌 握 胶 原 酶浓 度 、 Ⅱ 值 、 度 厦 孵 育 时 间 至 关 重 要 。 ｐ 温
肾小球 培养中， 球贴 壁与否是 Ｍｓ 小 Ｃ培 养成敢 的关髓。 一般接 种小球开始 的 ３ ｄ内 不应动 培养瓶， 以免干扰小 球贴 壁， 以后可适 当加入新鲜 培养液或换液。而 培 养器皿 以塑 料 表 面 利 于 肾小 球 或 Ｍ日 贴 壁 生 长。 Ｏ 肾小球 Ｍｓ ０鉴定 目前 尚缺乏一种特异 性单一 指标。一 般从其形态和功能 方面， 结合
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上 海 医 科 大 学 学 报
２ 卷 ２
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（）Ｍｓ ５ Ｇ传代：上 述原代培 养的 Ｍｓ Ｇ经 Ｈａ ｋ 液洗 涤后 ， 加 入 ０ ６ 胰 蛋 白 醇 ｎｓ ．％ 和 ０ ５ ．３ｍｍｏ／ ｌＬＥＤ Ａ 混合液， ３ 。 一６ ｎ 细胞 突起 回缩， Ｔ 置 ７Ｃ口 ， ｍｉ 间隙 增大， 郎吸去消化 掖 ， 入 完 全 培 养 液 中 止 消 化 。 用 暧管 欢 打 瓶 壁 ｉ胞 ， 之 脱 离瓶 壁 形 成 悬 液。 台 盼蓝 染 加 母 使
长成融台状 纯度极 高， 冻存 或传 代供 研究 用。 可 Ｍｓ 形 态 学特 征 Ｏ （） 光镜观 察； １ 相差 显微镜下生长活跃 的 Ｍｓ Ｇ体积 大， 常为 梭形 （ ２ 、不规则星形 圈 ） 或 三 角 形， 枝状 。 当 细 胞 密 集 对 可 重 叠 生 长。 细胞 经 商 定， 树 ＨＥ 染 色 后 普 通 光 镜 下 结 构 甚 清晰， 胞浆 多突起， 大量微丝 样结构。 居中央， 见 核 多呈 圆形或 椭圆形 （ ３ 。 图 ） （） 超 徽 结 构 观 察 ： 扫 描 电 镜 显 示 Ｍｓ 呈星 形。 表 面 有 无 数 长 短 不 一 突 起 ， 以此 ２ Ｏ 并 相互连接， 突起 表面可见 大量微丝 样结构 （ ４ 。透 射 电镜下 Ｍｓ 图 ） Ｏ也里皇形 或梭 形， 胞浆 内有 少 量分 布 的 线 粒 体、粗 面 内 质 网和 高 尔 基 体 。 然而 最 为 特 征 性 的是 位 于 细 胞 膜 下 和 细 胞突起 由的微丝结构。核 常居中， 圆形 或椭 圆形， 呈 核染 色质分 布甚为稀疏 （ ６ 。 图 ） （） 免疫 组化结果 ：Ｍｓ ３ Ｇ胞浆 内结蛋 白（ Ｂ 、 动蛋白 （ ７ 均为 阳性 而 细胞角 图 ）肌 图 ） 蛋 白、 ＶＩＩ因子则为 阴性。 从而分别 除外 肾小 球上皮细胞、内皮细胞混合生长 的可能 第 Ｉ 性。
２６ １ ｍ 和 ７ ｍ 的两道 重叠筛 网，分 离 得纯小球。 而 我们 采用 孔径 由大到小 的 （５ ， Ｏｐ 口 Ｏ １ ０ ５ｐｍ）三 道 重 叠 不 锈 锕 网 也 同 样分 得 高 纯 度 脱 去 包 氏囊 的小 球 。 分 离小 球 的 关 键 ５ 、７ 为 最 后一 道 筛 网 的孔 径 ， 般 大 鼠为 ５ —７ ｍ， 人 为 １ １ １ ４ ｍ。 一 ３ ５ 而 ５ — ８
白 （ ：０ 、肌动蛋 白（ ．０ ） １３） １ ３ ０ ，细胞 角蛋 白（ ．ｏ ） １１ ｏ 厦第 ＶⅡＩ因子 （ ．ｏ ） １ １ ｏ 为一抗， 常规
ＡＢ 法染 色 、 Ｇ ＤＡＢ 显色 。
结 果
肾小球的分 离及培 养
原 位灌洗后 经筛 网分离 的肾小球纯度极 高， 皆脱去包曼囊 （ 有
Ｊ． ｅ ｂｒ Ｋｒｉ ｅｇ法 对 正 常 大 鼠双 肾经 原 位 灌 洗 后 ， 分 离 肾 小 球 ， 体 外 培 养 ， 获 得 高 纯度 ｓ
Ｍ５ ， Ｏ 为进 一步进 行 Ｍ胄 。各种生物学特性 及肾小球疾病 发病 机理 的研 究奠定了基础。
方 法
Ｍｓ 分 离 地 化 Ｏ
（） 肾脏 原位灌洗 （ １ ； Ｄ大 鼠（ １ 图 ）８ 每只 ２ ｏｇ左右） ０ ８只麻醉 后仰 卧固定。 跛部消 毒。 剪
色 观 察 细 胞 活 力 并 计 数 ， 释 至 所 需 浓 度 后 分 装 入 几 个 培 养瓶 继 续 培 养。 稀 Ｍｓ 鉴 定 Ｇ 培 养 各 时 期 的 Ｍｓ Ｇ用 相 差 显 微镜 、 镜 （ 光 ⅡＥ 染 色 ）透 射 电镜 描 电镜 、 扫 作 常 规 观 察 ， 作 以下 免 疫 组 化 检 查 ：传 代后 Ｍｓ 并 Ｇ经 一２ 叼 甲醇 固 定， 以兔抗 大 鼠结蛋 ０
肾 小球 细胞 的 获 得 可 通 过 直 接 培 养分 离 的 小 球 ， 这 种小 球 培 养贴 壁慢 ， 胞 不 易 长 但 细
出。 一般用胶 原酶对分 离的小球进行清化。 经消化的小球结构疏 松、 贴壁时间缩短， 细胞 易 长出 ，但消 化过度， 小球块过碎漂浮 不沉 ， 反会影 响小球 的贴 壁。 肾小球消化中严格
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（ 稿 日期 ：９ ｏ 一Ｏ 收 １０ ５
辅 妻汇墙 １ ９ ２ ６ ９ ３ｌ ： ５
３ 谌 贻璞 等： 小球 系膜 细 胞培 养。 ｊ 京 医科大 学 学报 １ ｓ ｌ【］ ８ ５ 肾 ｂ § ９２ ４ ： ３ ４ 于力 方 等： 常＾ 肾小球 系膜细 胞 培养的 研究。 中毕 肾脏 病杂 志 １ ９ ２ ： Ｏ 正 ９ Ｏ０（） ７
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大 鼠 肾小 球 系膜 细 胞 培 养
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张 明 募・ 郭 依 陈琦 垒 铭 。 惠
（ 荦 学 蕃蓦 理 理学教 室、 上 基面 生 研 病理学 研童 Ｏ
肾小球 系膜 细胞 （ ｓｎ ｉｌ ｅ１ Ｍｓ 无论在 肾小 球生理 功能述是在病理反应 中 Ｍｅ￣ ｇａ ］． Ｏ） Ｏ 均 起着重要作用。 ７ Ｏ年代开 始国外对肾小球系膜细胞 的分 离纯化 及体外培养进 行 了 大 量 探索和研究 。国 内对 Ｍｓ 的培养工 作则报道较少，且各家方法不一 。 我们根据 Ｏ “
讨 论
经 灌 流 并 去 除包 氏 囊 的 肾 小 球 固 有 细 胞 主 要 有 兰 种 ： 脏 层 上 皮 细 胞 、ｌｓ 和 内皮 细 ｄＧ
胞。 由于内皮 细胞为一 种高分 化细胞， 需较 高条件 （ 加入 生 长因子） 如 才能生 长， 故从小球 中 长 出的 主 要 为前 两 种 细胞 。 目前 纯 Ｍｓ 的 获 得 主 要 是 根 据 以上 细胞 从小 球 中 长 出 的 Ｇ 生 长高峰 （ 上皮细胞为 ６ ， Ｇ为 ２ ） 最适血清浓度 （ ｄ Ｍｓ ｎ 、 上皮 细胞为 ６ Ｍ卣 形， ａ为 舯 筠） 、 是 否 包被培 养表面 （ 上皮细胞往往适于在胶原包被 的培 养表 简生 长， Ｍ月 亘 及是 否 而 Ｏ贝 否） 需特殊生 长因子等， 利用不 同培 养条 件选 择好 转种时机 ，即能不经克 隆 而 获 祷 高 纯 度
辛 除 法 综 合 判 定。 Ｉ Ｆ
（ 本文 圈 ， 见 插图 第 １ 页） 一 ４
参
考
文
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第 ２ ０卷
第 ３期
上 海 医 科 大 学 学 报
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