ELISA试剂盒问题解答手册

技

术

问

题

问

答

序言

为了更好的让广大客户了解ELISA试剂盒操作过程中出现问题及原因，特将大家普遍认为比较容易出现的问题进行归纳、

整理成册，并回馈给广大的客户。

本手册提到的问题均为分析手段，并未牵涉到具体实例，您可以根据相应的具体问题进行具体分析。在具体实验操作中，如本手册中未体现，希望大家及时与我们取得联系。

贵州勤邦食品安全科学技术有限公司

问题与解答

1.药物残留实验前处理过程中实验耗材（如离心管、玻璃管）重复使用最

理想的洗涤方法是什么？

实验完成后,先用流动自来水冲洗干净,再加入洗涤剂超声2h, 然后再用自来水冲洗干净，最后用去离子水清洗1到2次，60℃完全烘干后待用。

建议：超高阳性样本所使用的离心管或玻璃试管不再重复使用。

2.药物残留检测实验中对水质的要求：三蒸水、蒸馏水、纯净水还是去离

子水？

理论来说这几种水都可以满足分析要求,但对于某些项目来说还是有一定的区别,最好使用去离子水和三蒸水，蒸馏水和纯净水一般仅用于洗涤液的配置。

3.器具污染所造成的途径有那几种？

①检样过程中出现含量较高的阳性样品;

②实验器具没有清洗干净;

③高浓度标品贮备液保存不当造成污染。

建议：容易被污染或者使用周期较长的实验器具, 定期（3-5个月）更新一次。

4.ELISA方法可用于检测药粉样品吗？

针对不同成分的样品, 通过对应的样品前处理方法,消除干扰后, 可以用ELISA方法进行检测，但应防止与药残实验交叉污染。

5.同样一个样品，称取两个样检测两次，两次值差别较大，是取样原因还

是板间的变异？

正常情况下,板孔间的变异不会对样本的检测结果造成绝对的影响；样品的取样、前处理过程和分析过程中的操作误差是影响结果差别较大的主要原因。

6.药物残留实验前处理样品过程中所用的氮气是不是可换用压缩空气？

空气中的氧气是否会对药物产生氧化作用，进而影响试验结果？

一般情况下需要检测的目标物是非常稳定的药物，可以用压缩空气替换氮气, 药

物的氧化在此不会产生，如有特殊药物有氧化情况，说明书上会有明确标注。

7.将肉中药物残留成份转移到提取液中，最佳的离心力、离心时间是多少

（不同的试剂盒离心时间不一样）？

一般情况下，转速4500r/min, 离心时间5min到10 min ,离心力大于3000g即可。

8.呋喃四项检测是衍生化孵育时间和孵育温度多少为最佳？

37℃过夜孵育14到16h为最佳孵育环境,有实验证明过最低可以缩短至12小时,

但对于高阳性样本来说可能会出现差异,建议使用14-16h.

60℃孵育3h需严格遵守孵育时间。若时间允许的情况下，建议使用37℃过夜孵育，以便使药物冲分衍生化，能有效提高高阳性样本检测结果的准确性

9.添加回收率的测定方法是什么？添加回收实验时，添加浓度多少为好？

添加回收实验是验证整个实验过程检测结果的准确度。不同的试剂盒的不同种类

的样本, 按照说明书中对应的样本前处理方法进行实验。在添加的时候尽量避免在最低检测限以内或者超出试剂盒曲线外的添加，建议添加的最适浓度参照所需检测目标药物在相应组织中的判定限或定量限。同时，添加时根据具体的添加浓度对添加的高标进行适当的稀释,保证添加的准确性。

如硝基呋喃类药物组织的定量限为0.5ppb，添加回收时0.5ppb为最适添加浓度。

添加回收的体积公式:V=C*1000M/P,其中:V为添加的高标准体积（ul）,C为添加的浓度,P为高标准的浓度(ppb),M为样本的质量(g)。

10.脂肪存在为什么会造成试验的假阳性率比较高？

在提取过程中, 容易造成乳化, 对样本进行不正常的浓缩，易与杂质混合难以分离。乳化后一般利用60℃水浴加热半小时,最好是先把上层有机相去除后再利用水浴加热较好.第二种解乳化的方法是把整个乳化后的样本全部放入冰箱-20℃急冻室急冻30min或更长，回温后去除上层有机相再次离心后去上清液，取下层进行分析。

如氯霉素或其他在加入正已烷再加入复溶液进行操作时，可在加入正已烷后充分涡动1-2分钟，然后加入复溶液后涡动5-10s，即可在一定程度上防止乳化造成。又如硝基呋喃类代谢物的前处理中加入乙酸乙酯后形成乳化层，不易取到相应的量，可以在加入乙酸乙酯时，放大加入的量，然后取液相应增加，保证稀释倍数不变，也可在一定程度上防止乳化形成。

11.样品OD值落在药残标准曲线的那一区间值精确度最高？

一般在第三和第四标准之间精确度较高, 但是不同的试剂盒曲线的局部差异, 精确区间会稍有变化。一般在曲线上的近似直线段范围内较为准确．

12.OD值偏低由什么因素引起的?

整板ＯＤ值偏低:

✓反应温度偏低;

✓反应时间不够;

✓洗板时间过长或次数过多;

✓点板时环境温度过低；

✓酶标仪故障波长错误；钨光灯寿命将近,导致光强变弱)；

✓试剂盒有效期已过或将过；

✓某些试剂盒标准品需要稀释才能使用或试剂稀释倍数错误（如四环素类）；

✓试剂盒中的某些试剂变质或污染；

✓不同试剂盒混用，

✓试剂盒的回温时间较短；

✓试剂盒保存未按规定的方法或环境保存；

✓试剂盒处于极端条件下，比如放在贴着冰箱壁，试剂冻伤。

样本的ＯＤ值偏低:

✓样本的阳性太高（可做空白样本及阳性样本对照试验），

✓某些试剂盒的样本需要调节ＰＨ的没有调节到需要的ＰＨ范围；

✓某些试剂盒的复溶液需要稀释后才能使用的没有经过稀释；

✓样本前处理时没有去掉上层有机相，加样吸取到上层有机相；

✓样本被污染；