第七章-工业微生物诱变育种
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选择适于发酵设备条件的生产菌株便于推广。 3、选择纯种
单倍体、单核或少核。
4、菌株的稳定性
挑选合成能力强，遗传性状稳定的菌株。
5、连续诱变育种过程中出发菌株的选择
挑选每代诱变处理后具有一些表型改变的菌株。
6、选择出发菌株的其他因素
如孢子多、不产色素、生活能力强、生长速度快、糖氮利 用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素
1、培养基的选择 2、培养基斜面制备技术 3、接种密度 4、培养温度 5、培养湿度 6、试剂和原材料质量
四、了解产物各组分与培养条件的关系
如刺孢小单孢菌产生的庆大霉素，其中的C1是有效 的，C2是无效的，培养基中加入适量的磷和蛋白胨及加 大通风都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
1、孢子或菌体要年轻、健壮
采用分散法制备，力求90％以上为单孢子。 菌悬液浓度用平板计数、血球计数器计数和光密 度法测定。菌悬液的浓度，要求霉菌孢子约为106个 /mL，放线菌的孢子浓度约为106-107个/mL ，细菌的 细胞浓度为107-108个/mL。
2、菌悬液制备方法
产孢子的菌类：放线菌，霉菌应处理孢子。放线 菌和霉菌的孢子要稍加萌发后使用。
在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有 相当的知识和全面的了解。
诱变的工作量大，周期长,事先要做好充分的准备。
一、诱变前对出发菌株的了解
1. 区分不同菌落类型 土霉素产生菌的菌落
源自文库
土霉素产生菌不同菌落类型的形态及在不同培养基 中的效价
2. 出现不同菌落类型原因
遗传因素造成的菌落变化 非遗传因素造成的菌落变化：培养基组成；培养基 来源与质量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生长阶 段。
1、提高有效产物的产量； 2、改善菌种特性、提高产品质量； 3、简化工艺条件； 4、开发新品种。
第一节 诱变育种的试验设计和准备工作
诱变的结果是产生变异，负变机率高于正变。高 产突变型是多基因决定，需要多代诱发突变逐渐积累。
诱变育种工作包括：诱发突变、突变株的筛选和 高产突变株最佳环境条件的调整。
次用某一诱变因子会产生钝化反应。
常规做法：几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱
变实验，筛菌，测定生产能力。
（二）最适诱变剂量的选择
剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示。 合适剂量：应该使所希望得到的突变株在存活群体中
占有最大的比例。 最适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正向突
作用机制、菌种特性。 紫外线（形成嘧啶二聚体），5－BU（在复制过 程中取代DNA分子上相同结构的碱基成分），亚硝酸 （作用在嘌呤和嘧啶碱基上）
2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂
遗传稳定的出发菌株：强诱变剂 遗传不稳定的出发菌株：先纯化，再用温和诱变 剂处理。
3、参考出发菌株原有的诱变系谱 敏感：有的菌株对某一种或某一组合诱变因子敏感。 饱和现象：对诱变史很长的高产菌株来说，长期多
诱变育种的步骤和方法： 出发菌株的选择→单孢子菌悬液的制备→诱变剂及
诱变剂量的选择→诱变的处理方法→纯化分离等。
一、出发菌株
1、对一般出发菌株的要求 用作出发菌株有：野生型菌株、生产菌株、具有利
性状菌株、经过诱变的菌株、增变菌株等。 一般要求生长快，营养要求粗放，产孢子多，对诱
变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。 2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株
去壁菌对诱变剂敏感） （3）增强不产孢子的丝状菌诱变效应
四、诱变剂及诱变剂量
（一）诱变剂种类的选择
➢ 取决于诱变剂对基因作用的特异性和出发菌株的特性。
➢ 产量由多基因决定，并且菌体自身也有修复能力。 因此，诱变剂的诱变作用，不仅取决于诱变剂的种类选
择，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。
1、诱变剂的选择
二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系
考查生活史：如土霉素菌种原先要培养12d其实是 包含了三代的生活周期。各代高产性能不同。
研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性： 顶头孢菌素C的产量，随着其产生菌顶头孢霉菌的节孢 子体积增大或数量增加而提高。
考察菌落大小和颜色，如灰黄霉素产生菌荨麻青霉 紫色素越深，灰黄霉素产率越低。
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
第七章 工业微生物诱变育种
工业微生物中过程的三个阶段：
基因型改变
筛选菌种
产量评估
基本步骤 原种（出发菌株）→纯化→斜面→同步培养→离
心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理→平板 分离→斜面（活菌计数）→（变异率）→（初筛） → 斜面→ 斜面→性能鉴定→（复筛）→（再复筛） →保藏及扩大试验
工业微生物诱变育种的意义：
7、采用多出发菌株
选择3-4株出发菌种同时诱变。
8、了解菌种代谢特点
了解菌种的代谢特点有助于选择有效的出发菌株，如肌苷 酸产生菌。
二、出发菌株的纯化
菌种纯化的方法：
1. 划线分离法 2. 稀释分离法 3. 显微镜操纵器分离单孢子
三、单孢子或单细胞悬液的制备
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞 浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液）
金黄色葡萄球菌菌悬液：为24小时普通琼脂斜面 培养物，用5.5mL灭菌的0.03M磷酸盐缓冲液洗下来， 然后取5mL置于装有10mL的0.03M磷酸盐缓冲液中，通 过比浊法将菌液用2%蛋白质配制成4-6×105个/mL共 50ml为试验用。
3、制备原生质体作诱变剂 优点：
（1）异质体（丝状真菌菌丝有不同分化程度） （2）无细胞壁的阻挡（细胞壁会吸收诱变因子能量，
单倍体、单核或少核。
4、菌株的稳定性
挑选合成能力强，遗传性状稳定的菌株。
5、连续诱变育种过程中出发菌株的选择
挑选每代诱变处理后具有一些表型改变的菌株。
6、选择出发菌株的其他因素
如孢子多、不产色素、生活能力强、生长速度快、糖氮利 用快、耐消泡、粘度小等性状的菌株。
三、了解影响菌种生长发育的主要因素
1、培养基的选择 2、培养基斜面制备技术 3、接种密度 4、培养温度 5、培养湿度 6、试剂和原材料质量
四、了解产物各组分与培养条件的关系
如刺孢小单孢菌产生的庆大霉素，其中的C1是有效 的，C2是无效的，培养基中加入适量的磷和蛋白胨及加 大通风都有利于C1的合成，反之，C2的比例就上升。
五、快速准确的检测方法
建立一个适应于大规模筛选的有效检测方法是减少 诱变选育工作量的关键。
分光光度法 液相色谱法 气相色谱法
化学滴定法 薄层层析法
六、最佳的菌种保藏方法
事先要建立一个最佳的培养基、培养条件和适 宜的保藏方法，否则将前功尽弃。
第二节 诱变育种的步骤与方法
诱变育种的优缺点 优点：方法简单、投资少、收获大； 缺点：缺乏定向性。
1、孢子或菌体要年轻、健壮
采用分散法制备，力求90％以上为单孢子。 菌悬液浓度用平板计数、血球计数器计数和光密 度法测定。菌悬液的浓度，要求霉菌孢子约为106个 /mL，放线菌的孢子浓度约为106-107个/mL ，细菌的 细胞浓度为107-108个/mL。
2、菌悬液制备方法
产孢子的菌类：放线菌，霉菌应处理孢子。放线 菌和霉菌的孢子要稍加萌发后使用。
在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有 相当的知识和全面的了解。
诱变的工作量大，周期长,事先要做好充分的准备。
一、诱变前对出发菌株的了解
1. 区分不同菌落类型 土霉素产生菌的菌落
源自文库
土霉素产生菌不同菌落类型的形态及在不同培养基 中的效价
2. 出现不同菌落类型原因
遗传因素造成的菌落变化 非遗传因素造成的菌落变化：培养基组成；培养基 来源与质量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生长阶 段。
1、提高有效产物的产量； 2、改善菌种特性、提高产品质量； 3、简化工艺条件； 4、开发新品种。
第一节 诱变育种的试验设计和准备工作
诱变的结果是产生变异，负变机率高于正变。高 产突变型是多基因决定，需要多代诱发突变逐渐积累。
诱变育种工作包括：诱发突变、突变株的筛选和 高产突变株最佳环境条件的调整。
次用某一诱变因子会产生钝化反应。
常规做法：几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱
变实验，筛菌，测定生产能力。
（二）最适诱变剂量的选择
剂量：以诱变剂浓度和处理时间来表示。 合适剂量：应该使所希望得到的突变株在存活群体中
占有最大的比例。 最适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正向突
作用机制、菌种特性。 紫外线（形成嘧啶二聚体），5－BU（在复制过 程中取代DNA分子上相同结构的碱基成分），亚硝酸 （作用在嘌呤和嘧啶碱基上）
2、根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂
遗传稳定的出发菌株：强诱变剂 遗传不稳定的出发菌株：先纯化，再用温和诱变 剂处理。
3、参考出发菌株原有的诱变系谱 敏感：有的菌株对某一种或某一组合诱变因子敏感。 饱和现象：对诱变史很长的高产菌株来说，长期多
诱变育种的步骤和方法： 出发菌株的选择→单孢子菌悬液的制备→诱变剂及
诱变剂量的选择→诱变的处理方法→纯化分离等。
一、出发菌株
1、对一般出发菌株的要求 用作出发菌株有：野生型菌株、生产菌株、具有利
性状菌株、经过诱变的菌株、增变菌株等。 一般要求生长快，营养要求粗放，产孢子多，对诱
变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。 2、选择具有一定生产能力或某种特性的菌株
去壁菌对诱变剂敏感） （3）增强不产孢子的丝状菌诱变效应
四、诱变剂及诱变剂量
（一）诱变剂种类的选择
➢ 取决于诱变剂对基因作用的特异性和出发菌株的特性。
➢ 产量由多基因决定，并且菌体自身也有修复能力。 因此，诱变剂的诱变作用，不仅取决于诱变剂的种类选
择，还取决于出发菌株的特性及其诱变史。
1、诱变剂的选择
二、全面了解菌种特性及其与生产性能的关系
考查生活史：如土霉素菌种原先要培养12d其实是 包含了三代的生活周期。各代高产性能不同。
研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性： 顶头孢菌素C的产量，随着其产生菌顶头孢霉菌的节孢 子体积增大或数量增加而提高。
考察菌落大小和颜色，如灰黄霉素产生菌荨麻青霉 紫色素越深，灰黄霉素产率越低。
细菌：生长指数期，最好在诱变处理前进行摇瓶 振荡预培养，尽可能获得同步培养物。
某些不产孢子的真菌：菌丝体，最好采用年幼的 菌丝体进行诱变处理。获得的方法：菌丝尖端法、 处理单菌落周围尖端菌丝法和混合处理法。
菌丝尖端法
枯草杆菌黑色变种芽孢菌悬液：试验菌液用2%蛋 白胨配成3-4×105个/mL浓度共50ml。
第七章 工业微生物诱变育种
工业微生物中过程的三个阶段：
基因型改变
筛选菌种
产量评估
基本步骤 原种（出发菌株）→纯化→斜面→同步培养→离
心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液→诱变处理→平板 分离→斜面（活菌计数）→（变异率）→（初筛） → 斜面→ 斜面→性能鉴定→（复筛）→（再复筛） →保藏及扩大试验
工业微生物诱变育种的意义：
7、采用多出发菌株
选择3-4株出发菌种同时诱变。
8、了解菌种代谢特点
了解菌种的代谢特点有助于选择有效的出发菌株，如肌苷 酸产生菌。
二、出发菌株的纯化
菌种纯化的方法：
1. 划线分离法 2. 稀释分离法 3. 显微镜操纵器分离单孢子
三、单孢子或单细胞悬液的制备
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞 浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液）
金黄色葡萄球菌菌悬液：为24小时普通琼脂斜面 培养物，用5.5mL灭菌的0.03M磷酸盐缓冲液洗下来， 然后取5mL置于装有10mL的0.03M磷酸盐缓冲液中，通 过比浊法将菌液用2%蛋白质配制成4-6×105个/mL共 50ml为试验用。
3、制备原生质体作诱变剂 优点：
（1）异质体（丝状真菌菌丝有不同分化程度） （2）无细胞壁的阻挡（细胞壁会吸收诱变因子能量，