透射电镜常规样品制备流程(精)
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透射电镜样品制备流程
由于透射电镜能观察的样品必须很薄(60~70nm),所以透射电镜的样品准备要求很严格,方法也很单一,仅有一下两种方法:
一.负染色技术
负染色技术简单快速,可以显示生物大分子、细菌、分离的细胞器以及蛋白晶体等样品的形态、结构、大小以及表面结构的特征。
尤其在病毒学中,负染色技术有着广泛的应用。
样品要求:①样品悬液的纯度不要求很纯,但是如果杂质太多,如大量的细胞碎片,培养基残渣,糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。
尤其是不能有过多的糖类,因为在电子束的轰击下,糖类容易碳化而有碍观察,因此样品要适当提纯。
②样品悬液的浓度要适中,太稀在电镜下很难找到样品,太浓样品堆积影响观察。
操作流程:吸取样品悬液滴到有膜的铜网上,静置数分钟,然后用滤纸吸去多余的液体,滴上负染色液,染色1~2min后滤纸吸去负染色液,待干后用于电镜观察。
二、超薄切片技术
超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术,是生物学中研究细胞超微
结构最常用的技术。
广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。
一般厚度在10~100nm的切片称为超薄切片,制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。
超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节,和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。
但是,超薄切片切片过程更为细致与复杂,要求更严格,而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。
具体操作步骤、注意事项如下:
1.取材和前固定:快速的切取大小为0.5~1.0mm3的样品块,一分钟内把组织(样品)
块浸入2.5%戊二醛(进口品质)溶液(取样前来平台领取),每个离心管内装20个以上的样品块,作为一个样送到平台。
要求:①取材前一定要和工作人员取得电话联系!②取材选择部位要准确可靠,确保每块材料都是要观察的部位。
③所有植物样品一定要抽真空,能够沉底的样品也抽真空15mins,不能沉底的样品一定要抽真空致沉底!④细菌、散在细胞等不能成块的样品,加戊二醛固定液,离心沉淀后送到平台,由平台工作人员处理。
⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。
2.漂洗:用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次,每次15mins。
3.后固定:加入1%锇酸处理到样品变黑。
植物样品一般处理2.5hours,真菌、细菌
一般处理2hours,动物样品处理1hours。
注意事项:①锇酸剧毒物质,易挥发,操作时要在毒品柜中谨慎使用。
②锇酸比较昂贵,需特别节约使用。
4.漂洗:用1M PBS Buffer Ph 7.2冲洗3次,每次15mins。
5.脱水:室温下,丙酮30%-50%-70%-80%-90%每级作用30mins,纯丙酮在作
用3次,每次作用30mins。
6.渗透:其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。
植物样品需要的渗透梯度多、渗透
时间长。
其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。
以二叶龄水稻叶片为例,其渗透流程如下:无水丙酮/包埋剂=5:1作用12hours→无水丙酮/包埋剂=3:1作用12hours→无水丙酮/包埋剂=1:1作用12hours→无水丙酮/包埋剂=1:3作用12hours→无水丙酮/包埋剂=1:5作用12hours→纯包埋剂作用45℃作用12hours。
注意事项:包埋剂为强致癌剂,特别要注意规范操作!
7.包埋:用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中,45℃聚合12hours,60℃聚合36~
48hours。
8.超薄切片:超薄切片的切片面积最大不能超过0.5mm×0.3mm,比较难切的植物样
品要求切片面积更小。
超薄切片是在超薄切片机上进行,但是切出比较理想的超薄切片,却是一件不容易的工作。
做好需要有渗透、包埋好的包埋块,还要有好的切刀以及操作者的熟练技术等。
超薄切片前期需要准备载网和支持膜、修块、制刀等,前期准备工作至少需要半天时间。
超薄切片是极其精细、耗费眼力的工作,需要静下心来慢慢操作,切好一个样品至少需要1小时。
9.正染色:由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。
这些元素原子对电子
的散射能力很弱,相互之间的差别也很小。
尤其生物超薄切片被树脂所包埋,这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。
因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。
为了提高图像的反差,要对超薄切片进行电子染色。
这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色,它是利用重金属盐(如铅盐、铀盐等)与细胞的某些成分或结构结合,由于重金属对电子散射能力很强,使那些与其结合的结构或成份对电子散射能力增强,从而达到提高样品本身反差的。
目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。
操作流程是:超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟,去二氧化碳的双蒸水清洗3次,再用醋酸铀染色30分钟,双蒸水清洗3次,等超薄切片干燥后,即可上透射电镜观察。
注意事项:①醋酸铀具有放射性,使用时要特别注意。
②柠檬酸铅染液极易和空气中的二氧化碳反应形成
不溶解的黑色颗粒,污染切片。
柠檬酸铅染液一定要现用相配,所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。
③由于染色不可控制因素较多,产生污染的几率有40%,所以每个样品的切片一定要留出铜网作备份。