树突状细胞培养方法
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
树突状细胞的体外培养及鉴定
【 关键 词】 外周 血 ； 核细 胞 ； 突状 细胞 ； 外扩增 单 树 体
【 中图分类号１ ３ ２ １ Ｒ ９．ｌ
【 文献标பைடு நூலகம்码】 Ａ
【 文章编号】０４ ６ ７ （０７ ０－ １３ ０ １０ － ８９２ ０ ）２ ０ － ３ ｌ
ＣＩ ＩＩ ＴＥ ＡＮＤ Ｉ Ｔ、 Ｄ ＤＥＮＴⅡ Ｄ ｏＦＤＥＮ ＲＩ Ｃ Ｄ ＴＩ ＣＥＬＬＳＩ Ｖ Ｔ Ｎ Ｉ ＲＯ
（． １河北 工程 学院 医学 院 ，河北 邯郸
０ ６２ ；２ 北 京大 学基 础医 学院 ） ５ ０９ ．
【 摘要】 目的： 建立树突状细胞 （ｅｄ ｉｃｃｌ ， ｓ体外培养的方法。 ｄｎ ｒ ｉ ｅ ｓＤＣ ） ｔ ｌ 方法： 从正常人外周血分离获得单
核细 胞 ， 入ｒ Ｇ 加 ｈ Ｍ—Ｃ Ｆｌ ０ Ｕ／ｎ 、ｈ Ｌ ４ ０ Ｕ／ 体 外培 养 。 培养 ７ 的细胞 ， Ｓ ０ ０ ｒｌｒ ｌ － ５ ０ ｍｌ 取 天 采用 免疫 细胞化 学方 法和流 式细胞仪 测定细胞表 型 ， 并对其 进行鉴 定。 结栗 ： 免疫细 胞化 学方 法显示 ，０／ ９ ￣以上 培养７ 的细胞表 ， ０ 天
Ｍ ｏ ｏ ｙ ｅ ｒ ｂ ａ ｎ ｄ ｆ ｏ ｎ ｒ ｌ ｕ ｎｐ ｒｐ ｅ ａ ｌ ｏ ｎ ｕ ｔ ａ ｅ ｎ ｖｔｏ ｗｉ ＧＭ － Ｆ １ ０ Ｕ／ ｎ ｃ ｔｓ ｗｅ ｅｏ ｔ ｉ ｅ ｍ ｏ ｍａ ｍａ ｅ ｈ ｒ ｌ ｏ ｄ ａ ｄｃ ｌ ｖ ｔｄ／ ｉ ｔ ｒ ｒ ｈ ｉ ｂ ｉ ｒ ｈ ｈ ＣＳ ０ ０
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Ｊ ０ＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥ Ｃ ＮＧＤＥ Ｍ Ｅ ＣＡＬ ＣＯＬ ＧＥ ＤＩ ＬＥ
树突状细胞培养方法
树突状细胞培养方法树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是一类免疫细胞，主要负责识别和激活T细胞，发挥着重要的免疫调节和抗肿瘤等作用。
为了进行树突状细胞的研究，科研人员需要对其进行体外培养。
本文将介绍常用的树突状细胞培养方法。
1.制备树突状细胞前驱细胞：树突状细胞前驱细胞主要存在于外周血和骨髓中。
首先，采集外周血或骨髓，并将其进行红细胞裂解。
然后，用PBS洗涤样品，离心沉淀细胞。
最后，将细胞进行培养。
2.培养基的选择：培养树突状细胞需要选择适宜的培养基。
目前常用的培养基有RPMI1640、DMEM等。
添加10-20%的胎牛血清（FBS）可以提供必要的生长因子和营养物质。
3.添加生长因子：在培养树突状细胞的过程中，可能需要添加一些生长因子来促进细胞的分化和增殖。
常见的生长因子包括GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）。
可以将这些生长因子添加到培养基中，以达到最佳生长条件。
4.细胞培养条件的控制：树突状细胞对培养条件非常敏感。
因此，需要对温度、湿度、CO2浓度等参数进行严格控制。
一般来说，将细胞培养在37摄氏度、5%CO2的培养箱中。
5.细胞的分离和传代：在树突状细胞培养过程中，细胞会不断增殖。
为了保证细胞的活力和稳定性，需要定期分离和传代细胞。
可以使用胰酶等消化酶将细胞从培养瓶中剥离，然后进行细胞计数并按照一定比例进行传代。
6.细胞质量的评估：在培养树突状细胞的过程中，需要对细胞质量进行评估。
可以通过使用流式细胞仪等设备来检测细胞表面标记物的表达情况，以及细胞活力、树突状突起的形态等指标来评估细胞的质量。
7.树突状细胞的激活：树突状细胞的主要功能是激活T细胞。
为了使树突状细胞具备充分的抗原递呈能力，可以使用多种促进细胞激活的方法，如脂多糖、TNF-α等。
总结：树突状细胞培养方法包括制备前驱细胞、培养基选择、生长因子添加、细胞培养条件控制、细胞分离和传代、细胞质量评估以及细胞的激活等步骤。
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
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小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养
大鼠骨髓树突状细胞的分离和培养杨贺勤;张震宇【期刊名称】《现代妇产科进展》【年(卷),期】2009(18)7【摘要】目的:探讨体外分离和培养大鼠源性树突状细胞的方法,及其经卵巢肿瘤提取物致敏后在体内诱发抗肿瘤免疫效应。
方法:(1)取大鼠骨髓悬液,经Tris-NH4Cl裂解红细胞后得到大鼠骨髓单个核细胞;(2)应用大鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rrGM-CSF)、大鼠重组白细胞介素4(rrIL-4)、大鼠重组肿瘤坏死因子-α(rrTNF-α)进行体外培养;(3)培养第5天时加入NuTu-19 Fischer 344大鼠卵巢肿瘤细胞提取物,获得负载卵巢肿瘤提取物的树突状细胞;(4)体内实验检测DC诱发抗肿瘤免疫效力。
结果:(1)大鼠骨髓来源的骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNC)在相关细胞因子作用下可培养出成熟的树突状细胞;(2)体内实验表明,预先免疫的大鼠肿瘤出现时间较晚,肿瘤生长速度较慢,与对照组有显著差异(P<0.05),抑瘤率59.4%;治疗组大鼠在实验过程中肿瘤体积小,最终肿瘤质量轻,与对照组有显著差异(P<0.05),与先行免疫组无明显差异(P>0.05),抑瘤率69.3%。
结论:大鼠骨髓来源的BMMNC可培养出成熟的树突状细胞。
DC可负载并提呈肿瘤提取物,体内实验显示肿瘤提取物致敏的树突状细胞可以杀伤肿瘤细胞。
【总页数】4页(P486-489)【关键词】树突状细胞;大鼠,近交F344;肿瘤提取物;细胞培养【作者】杨贺勤;张震宇【作者单位】首都医科大学宣武医院妇产科;首都医科大学附属北京朝阳医院妇产科【正文语种】中文【中图分类】R737.33【相关文献】1.大鼠骨髓来源树突状细胞的体外分离培养鉴定初步研究 [J], 黄江波;罗志刚;刘宇明;刘利;何群君;言彩红;李建军;龙向阳2.大鼠骨髓来源树突状细胞的分离、培养及鉴定 [J], 张升宁;李立;冉江华;邵剑春;李铸;刘静3.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰4.大鼠骨髓树突状细胞的体外分离培养及生物学特性研究 [J], 叶建新;陈卫昌;黄小平;高楠5.大鼠骨髓树突状细胞的分离培养及HMGB1/TLR4信号通路的调控作用 [J], 王涵磊;薛继阳;葛捍伟;夏杰;林炜;赵琦峰;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
小鼠树突状细胞(DC)培养
8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。
方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。
在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。
结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。
流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。
淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。
结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。
【关键词】树突状细胞；磁珠；流式molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sortingperipheral blood mononuclear cells (pbmc) with dynal magnetic negative isolation kit. monocytes were then differentiated into immature dendritic cells stimulated by the combination of interleukin-4 (il-4) and granulocyte-macrophagecolony-stimulating factors (gm-csf) for 7days. cells were analyzed for phenotype by flow cytometry。
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法
专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。
该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。
本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。
申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究
・５ ６１・
人 外 周 血 来 源树 突 状 细 胞 的诱 导 及 培 养 方 法 的研 究
张 秀敏 曲 萍 郭风 袁媛 王净 王超 王 慧 （ １第四 军 医大学基础 部 病理 与病理 生理 学教研 室 ； 四军 医大 学教 学实验 中心 ； ２第 ３第 四军 医大 学西京 消化 病 医院 陕西 西安 ７０３ ） １０２
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来源骨髓的树突状细胞培养方法特征及其合理时间
来源骨髓的树突状细胞培养方法特征及其合理时间吴舰宇;宋春芳;许评;刘锐【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2005(009)023【摘要】目的:观察从骨髓来源的免疫辅佐细胞树突状细胞的培养操作技术及合理的培养时间.方法:实验于2003-10/2004-12在卫生部细胞移植重点实验室进行.树突细胞来源为健康SD大鼠的骨髓细胞,分别加入4种细胞因子:重组大鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子5 μg/L,重组大鼠白细胞介素45 μg/L,重组大鼠肿瘤坏死因子α 10 μg/L,重组大鼠γ干扰素20μg/L,共培养2周.每隔2 d加细胞因子1次,保持各细胞因子的浓度不变,分离树突细胞采用"培养黏附法".在培养的第3天吸去上清后重新加入培养液,在培养2周后收获悬浮的树突状细胞,分离树突细胞采用"培养黏附法".在培养的第1,3,5,7,9,11,13,15天用光学倒置显微镜观察细胞的形态;取一部分细胞在培养的第7,11,13,15天行流式细胞仪检查,并用PE标记的抗大鼠CD86单克隆抗体检测它的成熟度(CD86单抗阳性为成熟).结果:①树突状细胞的形态:从培养第7天开始细胞周围开始逐渐伸出突起,第13天以后突起五六支左右,且长度逐渐缩短,成熟的树突状细胞伸出长短不等的突起,类似神经细胞的树突.②培养所得的树突状细胞数量:1只大鼠平均得到(1.18±0.21)×107.③树突状细胞的成熟度:培养第7,11,13,15天CD 86单抗的阳性率分别为30%,80%,92%,94%.结论:应用骨髓来源的树突状细胞,在两种常规的细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素4基础上加入肿瘤坏死因子α和γ干扰素,培养2周,应用培养黏附法分离树突状细胞,可得到成熟的树突状细胞,且数量较多.【总页数】2页(P48-49)【作者】吴舰宇;宋春芳;许评;刘锐【作者单位】哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科,黑龙江省,哈尔滨市,150001;哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科,黑龙江省,哈尔滨市,150001;哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科,黑龙江省,哈尔滨市,150001;哈尔滨医科大学附属第一医院普外一科,黑龙江省,哈尔滨市,150001【正文语种】中文【中图分类】R471【相关文献】1.人外周血来源树突状细胞的诱导及培养方法的研究 [J], 张秀敏;曲萍;郭风;袁媛;王净;王超;王慧2.大鼠骨髓来源树突状细胞的分离与免疫学特征 [J], 翟妍;张震宇;乔宝丽;刘晋伟3.外周血PBMC来源的树突状细胞的快速无血清培养方法及细胞信号转导机制 [J], 吴军;王晓怀;杨德懋;杨太成;王捷;陈政良4.基于手法筛选的小鼠骨髓树突状细胞的体外培养方法 [J], 郑磊;顾春瑜;王前;包杰;裘宇容5.小鼠骨髓来源树突状细胞与NS_1骨髓瘤细胞的融合瘤苗研制 [J], 张义国;董子明;杨洪艳;郑智敏;赵明耀;吴皓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
DC培养方法
树突状细胞（DC）培养方法准备：小鼠（8-10周龄）、玻璃皿（用于解剖小鼠）、培养皿（塑料，DC在光滑的皿里转化的好，因此最好使用一次性的塑料培养皿）、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管（50ml、100ml用饭盒多装一些）、锡箔纸、1ml注射器。
细胞因子：GM-CSF、IL-4高压灭菌：除锡箔纸、注射器，其他物品都需要高压灭菌。
实验步骤：1．取下小鼠的四肢（后两肢最好），分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤（用纱布反复的搓），完全暴露出骨及其附带关节，注意不要离断关节。
将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨。
2．用1ml注射器吸取GKN（1640也可以，但费用较高），冲洗骨髓至骨完全变白，吹入两个离心管，便于离心找平。
3．1000转5分钟离心，倒掉上清液，再用1640悬起再离心一次，倒掉上清液。
4．加细胞培养液，将骨髓细胞重悬。
一只小鼠大概分4个培养皿，重悬的细胞总量尽量保持4ml。
5．细胞至于培养皿，补充培养基。
即1ml细胞+4ml培养液。
6．加入细胞因子，IL-4和GM-CSF以向DC转化。
GM-CSF 20 ng/ml加入浓度IL-4 10 ng/ml用锡箔纸包裹，避光放入培养箱。
轻拿轻放不可摇晃。
7．第三天（之前不可拿出）等量加入培养基即4ml，并加入对应量的细胞因子。
8．第6~7天骨髓细胞中可转化为DCS（镜下）（预计：50ml细胞培养液、100mlGKN，）GKN平衡盐缓冲液NaCL 8gKCL 0.4gNa2HPO4·12H2O 3.56gNaH2PO40.78g1L 配好后进行过滤除菌。
(NaH2PO4·2H2O 1.014g)葡萄糖 2.0g酚红0.01g去离子水（高压灭菌）由于实验室中仅有NaH2PO4·2H2O因此换算如下：NaH2PO4 NaH2PO4·2H2O（Na：23；P：31）相对分子量120 156质量0.78 1.014因此加NaH2PO4·2H2O为1.014g.1640培养基NaHCO3 2g1640培养基粉1袋1L 用0.22µm滤膜过滤去离子水（高压灭菌）细胞培养液普通1640培养液＋巯基乙醇（终浓度15µmol/L）＋Hepes（终浓度：10mmol/L）＋双抗＋进口胎牛血清1．巯基乙醇：母液为14.4mol/L，先用去离子水进行1000倍稀释，浓度变为14.4mmol/L （相当于14.4µmol/ml），在每升的培养基中加入1ml即可（相当于再进行1000倍稀释），终浓度近似为15µmol/L。
dc细胞成熟条件(二)
dc细胞成熟条件(二)DC细胞成熟条件1. 引言在免疫学研究中，树突状细胞（dendritic cell，简称DC细胞）被认为是非常重要的免疫细胞类型。
DC细胞可以促进和调节机体的免疫应答，因此对于深入研究DC细胞的成熟条件具有重要意义。
2. DC细胞的来源DC细胞可以从骨髓、外周血和淋巴组织等多种来源获得。
其中，从外周血中获得的DC细胞被广泛应用于临床和研究领域。
3. DC细胞的培养条件DC细胞的培养条件对于其成熟和功能发挥起着至关重要的作用。
以下是一些常见的DC细胞培养条件：•细胞培养基：常用的培养基包括RPMI 1640、DMEM等，其中加入10% FBS（胎牛血清）是常见的做法。
•细胞因子：通常需要使用GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）和IL-4（白细胞介素4）等细胞因子来促进DC细胞的生长和分化。
•温度和CO2浓度：DC细胞的培养通常在37摄氏度的高湿度培养箱中进行，其中CO2浓度保持在5%左右。
•培养时间：一般情况下，DC细胞的培养需要持续5-7天，以使其达到成熟状态。
4. DC细胞的成熟标志DC细胞的成熟可以通过以下标志进行检测：•表面分子的表达：成熟的DC细胞通常表达CD80、CD86等共刺激分子，这些分子能够促进T细胞的激活。
•分泌细胞因子：成熟的DC细胞能够分泌IL-12、TNF-α等细胞因子，这些分子对于免疫应答的调节起着重要作用。
•胞内酶的活性：成熟的DC细胞通常具有较高的胞内酶活性，比如酸性磷酸酶等。
•形态学特征：成熟的DC细胞表现出较大的体积和突起的形态，与非成熟的DC细胞相比更容易形成细胞凝聚体等结构。
5. 结论通过合理的培养条件，可以促进DC细胞的成熟，并使其具有更好的免疫调节功能。
研究和掌握DC细胞的成熟条件，对于深入了解和利用DC细胞在免疫治疗等领域的应用具有重要意义。
以上是一些关于DC细胞成熟条件的简要介绍，希望对您有所帮助。
参考文献： 1. Kapsenberg ML, Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization, Nat Rev Immunol, 2003. 2. Banchereau J, Steinman RM, Dendritic cells and the control of immunity, Nature, 1998.。
人树突状细胞的体外培养和鉴定
人树突状细胞的体外培养和鉴定
安利峰;胜利;李敏
【期刊名称】《西北民族大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2004(25)3
【摘要】目的:探索在体外分离培养人外周血树突状细胞的方法,同时为进一步研究树突状细胞工作奠定实验基础.方法:采用Ficoll、Precoll和Panning法分离和纯化人外周血DC,再加GM-CSF(100 μg/mL)和IL-4(10 μg/mL)诱生出大量树突状细胞,并进行免疫组化鉴定.结果:培养到第3天的DC扫描电镜可见DC伸出的树突状突起,呈毛刺状.培养到第7天的DC扫描电镜可见细胞胞体体积变大.这些毛刺状细胞表面有丰富的呈分叉的树突状胞质突起,某些突起形成薄片状结构,培养后的DC细胞呈S-100蛋白阳性染色.结论:人外周血树突状细胞可以在体外大量培养.【总页数】4页(P82-85)
【作者】安利峰;胜利;李敏
【作者单位】兰州医学院病理教研室,甘肃,兰州,730000;西北民族大学,医学院,甘肃,兰州,730030;兰州医学院病理教研室,甘肃,兰州,730000
【正文语种】中文
【中图分类】R735.8
【相关文献】
1.少量人外周血体外培养鉴定单核细胞来源树突状细胞方法初探 [J], 陈静思;王华;罗晓燕
2.人脐血来源树突状细胞的体外培养及鉴定 [J], 田慧;祁岩超;王远东;杨波;卢敏莹;申鸿卓;潘东晓
3.健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定 [J], 陶晓根;莫宝定;陈剑;张蕾;刘宝;王锦权
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树突状细胞的培养及成熟的鉴定_李望
树突状细胞的培养及成熟的鉴定李望，张升宁，冉江华，苏晓三，李来邦，陈奕明（昆明市第一人民医院肝胆胰一科，云南昆明６５０１０１）［摘要］目的探讨人体外周血树突状细胞在体外培养诱导其成熟的方法，通过得到成熟的细胞培养技术，对树突状细胞功能的研究奠定实验基础．方法通过Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法得到单个核细胞，再诱导使其分化、扩增、纯化形成稳定的树突状细胞，通过树突状细胞自身形态、特异性表型，抗原摄取能力，鉴别培养的细胞，从而得到具有典型特征的树突状细胞．结果树突状细胞培养第７天，加入ＬＰＳ后，倒置显微镜及扫描电镜下观察，树突状细胞成熟中，细胞胞质增大，细胞膜表面能形成大量树突状突起，表面标志物ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ的表达增高（Ｐ＜０．０５），共聚焦显微镜下，成熟的树突状细胞对抗原的吞噬能力减弱．结论Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法能够得到稳定的树突状细胞体外培养体系．［关键词］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法；树突状细胞；表型；抗原；吞噬［中图分类号］Ｒ３９２．１２［文献标识码］Ａ［文章编号］２０９５－６１０Ｘ（２０１５）０３－００３４－０４ＴｈｅＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＩｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭａｔｕｒｅＤｅｎｄｒｉｔｉｃＣｅｌｌｓＬＩＷａｎｇ，ＺＨＡＮＧＳｈｅｎｇ－ｎｉｎｇ，ＲＡＮＪｉａｎｇ－ｈｕａ，ＳＵＸｉａｏ－ｓａｎ，ＬＩＬａｉ－ｂａｎｇ，ＣＨＥＮＹｉ－ｍｉｎｇ（Dept.of Hepato-biliary-pancreatic Surgery ，The 1st People ’s Hospital of Kunming ，Kunming Yunnan６５０１０１，China ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｉｎｄｕｃｉｎｇａｎｄｃｕｌｔｕｒｉｎｇｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｉｎｖｉｔｒｏ，ｉｎｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｐｒｅｐａｒｉｎｇｔｈｅｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ（ＤＣｓ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＣＤ１４＋ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ（ＰＢＭＣ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．ＴｈｅｓｔａｂｌｅｍａｔｕｒｅＤＣｓｗｅｒｅｈａｒｖｅｓｔｅｄｂｙｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎ，ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＴｈｅｔｙｐｉｃａｌＤＣｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｐｈｅｎｏｔｙｐｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｗａｓｉｒｒｅｇｕｌａｒ，ａｎｄｐｌｅｎｔｙｏｆｒａｄｉａｌｄｅｎｄｒｉｔｅｓｆｒｏｍｃｅｌｌｂｏｄｉｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｔｈｅｉｎｖｅｒｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＤ８３，ＣＤ８０，ＣＤ８６ａｎｄＨＬＲ－ＤＲｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｓｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｎｇｏｆＤＣｓａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒｔｅｓｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｉｍＤＣｓｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ，ｗｈｉｌｅｉｔｗａｓｗｅａｋｅｎｅｄｉｎｍＤＣｓ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｉｍＤＣｓｃｏｕｌｄｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏＤＣｓｂｙＦｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅｇｒａｄｉｅｎｔｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ；Ｄｅｎｒｄｉｔｉｃｃｅｌｌｓ；Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ；Ａｎｔｉｇｅｎ；ＰｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓJournal of Kunming Medical UniversityCN 53-1221/R昆明医科大学学报2015，36（3）：34～37［基金项目］云南省科技厅－昆明医科大学联合专项基金资助项目（２０１１ＦＺ２９９）［作者简介］李望（１９８６～），男，湖南株洲市人，医学硕士，住院医师，主要从事肝胆外科临床及研究工作．［通讯作者］张升宁．Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｓｎ８１３＠１６３．ｃｏｍ树突状细胞是机体内发现的具有最强专职抗原提呈细胞，因其在成熟过程中能伸出大量树突样突起而得名，人体树突状细胞起源于造血干细胞，外周血树突状细胞在数量上不足外周血单个核细胞的１％，它能摄取、加工处理抗原，并能将处理后的抗原递呈给Ｔ淋巴细胞．未成熟的树突状细胞具有较强的迁移能力及摄取、加工抗原能力，成熟的树突状细胞能有效激活初始型Ｔ淋巴细胞，并能启动、调控并维持免疫应答［１］．１材料和方法１．１材料外周血细胞由健康、成人自愿捐献，淋巴细胞分离液（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＲＰＭＩ－１６４０培养液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＲｈＧＭ－ＣＳＦ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），重组人白介素４（ｒｈＩＬ－４）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），脂多糖（ＬＰＳ）（ｓｉｇｍａＵ．Ｓ．Ａ），胎牛血清（ｈｙｃｌｏｎｅＵ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＦＩＴＣ－ＣＤ８６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－ＣＤ１１ｃ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＰＥ－５．５ＨＬＡ－ＤＲ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ），ＯＬＹＭＰＵＳ倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ），微型扫描电镜（日立，ＴＭ１０００），流式细胞仪（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ），激光共聚焦显微镜（ＬｅｉｃａＳＰ５０）．１．２实验方法１．２．１树突状细胞培养抽取空腹、健康成人外周血细胞，肝素抗凝，将细胞生理盐水稀释，加入淋巴细胞分离液离心分层，取第二层单个核层细胞层，３７℃５％ＣＯ２培养箱中孵育２．５ｈ，获取贴壁的单个核细胞层，经含ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍＬ），ｒｈＩＬ－４（５０ｎｇ／ｍＬ）的用ＲＰＭＩ－１６４０完全培养基孵育１ｄ后，即得到未成熟的树突状细胞，诱导树突状细胞第６天用脂多糖（ＬＰＳ）刺激产生成熟的树突状细胞．１．２．２树突状细胞形态学观察分别于树突状细胞培养第１天，第６天，第７天，倒置显微镜下观察树突状细胞形态的改变．收集培养７ｄ的树突状细胞，经多聚赖氨酸沉淀于盖玻片上，用３％的戊二醛和１％饿酸固定，经乙醇梯度脱水，扫描电镜下观察树突状细胞形态．１．２．３细胞表型检测在２．０×１０５／ｍＬ的树突状细胞悬液中，分别加入ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ单抗，２ｈ后，经ＰＢＳ离心洗涤，加入抗原，４５ｍｉｎ后流式细胞检测．１．２．４分别于树突状细胞培养第６天及第７天，加入ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，３７℃５％ＣＯ２培养箱中继续孵育１ｄ，准备ＰＥ－ＣＤ１１ｃ荧光素标记的单克隆抗体于２００μＬ的ＰＢＳ，至期望浓度．单抗放置于冰上．低温保存，共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力．１．３统计学处理实验数据以均值±标准差（x±s）表示，数据处理应用ＳＰＳＳ软件包进行．流式细胞组间差异比较采用配对ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义．２结果２．１倒置显微镜下观察树突状细胞的形态从倒置显微镜下可以看出，树突状细胞在培养第２天细胞呈均匀分布，形态单一，散在排列．晃动培养板可见随板晃动的细胞．在散在排列的细胞中，可分辨出呈团簇状排列的细胞团块．细胞培养第６天，加入ＬＰＳ后，可见细胞较大，胞质丰富，悬浮的细胞，细胞膜表面分布许多分枝状突起，见图１．ＡＢＣＤ图１树突状细胞经分离、诱导、培养后不同时期树突状细胞的生长变化Ｆｉｇ．１ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｅｒｉｏｄｏｆＤＣｓａｆｔｅｒｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＡ：０ｄ（２００×）；Ｂ：２ｄ（４００ｘ）；Ｃ：６ｄ（４００×）；Ｄ：７ｄ（４００×）．３５第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定表１树突状细胞成熟前后细胞表型阳性细胞数改变［％，（x ±ｓ）］Ｔａｂ．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ［％，（x ±ｓ）］树突状细胞ＣＤ１１ｃＣＤ８０ＣＤ８６ＨＬＡ－ＤＲ加入ＬＰＳ前３７．０±１．５１７．０±１．１１７．２±０．９５４．２±０．４加入ＬＰＳ后３９．０±２．５２４．９±０．７＊５９．３±２．５＊６５．９±１．６＊图２培养第７天树突状细胞（５０００×）Ｆｉｇ．２ＴｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆＤＣｓｏｎｔｈｅ７ｔｈｄａｙａｆｔｅｒｃｕｌｔｕｒｅ（５０００×）加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图３树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．３ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ与加入ＬＰＳ前比较，＊Ｐ＜０．０５．２．２扫描电镜观察树突状细胞形态电镜下观察树突状细胞，细胞表面粗糙，有层叠状褶皱，细胞膜上分布大量外生的突起，见图２．２．３树突细胞表型变化加入ＬＰＳ前后，树突状细胞表型有明显改变．ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ在加入ＬＰＳ前后，其细胞阳性表达率明显增加，差别都具有统计学意义（Ｐ＜０．０５），说明加入ＬＰＳ后，树突状细胞共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８６及ＭＨＣ－ＩＩ类分子的表达增加．而ＣＤ１１ｃ加入ＬＰＳ前后，差别无统计学意义（Ｐ＞０．０５），提示ＬＰＳ对ＣＤ１１ｃ无明显影响，见图３、图４及表１．２．４共聚焦显微镜下观察树突状细胞吞噬抗原能力图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光，见图５．共聚焦显微镜下可看到经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记的细胞膜，使细胞膜表面呈现红色荧光，并可辨别树突状细胞表面形态，树突状细胞表面不规则，有大量外生的树突状突起，细胞内可见ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，呈现绿色荧光的抗原，在细胞内部均匀分布．加入ＬＰＳ后，随树突状细胞的成熟，树突表面突起明显增加，但细胞对抗原的摄取明显减弱．第３６卷36昆明医科大学学报图４树突状细胞成熟前后细胞表型的变化Ｆｉｇ．４ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前图５示树突状细胞成熟前后抗原吞噬能力的比较（×８００）Ｆｉｇ．５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｎｔｉｇｅｎｅｎｇｕｌｆｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＤＣｓａｆｔｅｒａｎｄｂｅｆｏｒｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎ（×８００）图中细胞膜经ＰＥ－ＣＤ１１ｃ标记，共聚焦显微镜下呈红色荧光，抗原为ＦＩＴＣ－ＯＶＡ标记，共聚焦显微镜下呈绿色荧光．３７第３期李望，等．树突状细胞的培养及成熟的鉴定３讨论３．１从形态学上分析树突状细胞１９７３年Ｓｔｅｉｎｍａｎ首次发现树突状细胞，研究中发现树突状细胞在免疫应答机免疫耐受中占有重要地位，树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ＤＣ）广泛分布于脑以外的全身组织及器官，仅占人外周血单个核细胞的１％，因其具有许多分枝状突起故名，在倒置显微镜下［２］，树突状细胞培养第１天，在ＩＬ－４及ＧＭ－ＣＳＦ诱导下，细胞由散在、均匀排列的单加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ前加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后加入ＬＰＳ后独细胞，逐渐形成大量贴壁的细胞集落团块，细胞大小从整体上观察均匀一致，未见明显突起．而树突状细胞培养至第７天，加入ＬＰＳ后，从培养液中可明显辨别出大量细胞质丰富，在细胞培养液中呈悬浮状态的树突状细胞，细胞膜表面呈现许多分枝状突起，细胞集落团块减少或消失．电镜下，观察树突状细胞，细胞较大，细胞表面粗糙，有大量外生型突起．本实验采用Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ梯度离心法，从外周血中分离出ＣＤ１４＋单个核细胞，根据树突状细胞短暂性贴壁的特性，分离出树突状细胞，极大简化实验分离过程，并且能够避免在间接贴壁中收集转移贴壁细胞对前体细胞的丢失，此实验方法在大多实验中得到证实［３，４］．在ＣＤ１４＋细胞诱导成熟过程中，加入ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４，能使ＣＤ１４＋单个核细胞向未成熟的树突状细胞转化，ＧＭ－ＣＳＦ是树突状细胞发育重要的细胞因子，能诱导单个核细胞形成细胞集落，并生产少量树突状细胞，ＩＬ－４的加入，能抑制中性粒细胞及巨噬细胞的产生，促进单核细胞向未成熟树突细胞转化［５］，在试验中，倒置显微镜下观察的大量集落刺激单位形成相一致．脂多糖是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，加入磷酸脂多糖（ＬＰＳ）后，未成熟细胞摄取ＬＰＳ，并与Ｔｏｌｌ样受体４结合，增强ＩＦＮ的表达，从而导致未成熟树突细胞向成熟树突状细胞转化［６］．３．２从表型上分析树突状细胞未成熟树突状细胞表面表达低水平的共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ类分子，而高表达一系列受体，如Ｔｏｌｌ样受体、Ｃ型凝集素等，其形态与功能相适应，高表达的受体有利于未成熟细胞识别、摄取抗原相关的物质．一旦未成熟树突状细胞受到炎性刺激，未成熟细胞则会向成熟细胞转化，其中共刺激分子及ＭＨＬ－ＩＩ表达水平显著提高，其意义在提供Ｔ细胞活化的信号．如Ｔ细胞受体与ＭＨＣ－抗原复合体结合传递信号，Ｔ细胞表型ＣＤ２８与ＣＤ８０／ＣＤ８６结合传递信号，从而启动获得性免疫应答［７］．实验中，树突状细胞ＬＰＳ刺激后，ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＨＬＡ－ＤＲ的表型显著较刺激前表达增高，提示未成熟树突状细胞向成熟细胞转化，这种现象与理论相适应．实验中发现，ＣＤ１１ｃ在ＬＰＳ刺激前后，都出现高表达现象，提示ＣＤ１１ｃ可能是树突状细胞共有表型，有待进一步研究证实．从抗原摄取能力分析树突状细胞未成熟树突细胞具有较强的抗原吞噬能力，抗原通过与树突状细胞Ｔｏｌｌ样受体结合，并通过内（下转第４４页）发症和医疗意外；与其他行业相比，医务人员面对的是身有疾病的患者，其工作关系到病人的生命的安全，行业的特殊性要求他们必须要有更强的责任心，其职业行为必须更加严格规范．医院的各项医疗规章制度是对医务人员的基本要求，若不严格执行将给患者带来极大的安全隐患，也使医院和医务人员在面对纠纷时处于十分被动的境地．医疗纠纷虽然不可避免，但是通过医院管理者对其成因的分析，可以在一定的程度上防范医疗纠纷的发生．医院管理部门要不断修订和完善各类制度规范，还要加大宣传、教育和督导力度，提高医务人员的医疗水平和执行力，确保各项制度规范严格落实．只有这样才能有效的控制医疗纠纷的发生，才能为患者就医提供更加舒适、更加轻松的医疗环境．［参考文献］［１］唐春爱．２２４７７例出院病人疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国医院统计，２００８，１５（４）：３４６－３４７．［２］李雅立．出院患者２２４５９例次疾病构成帕累托图分析［Ｊ］．中国冶金工业医学杂志，２０１１，２８（６）：６３０－６３１．［３］张涛．医疗纠纷的成因探讨［Ｊ］．国际护理学杂志，２００７，２３（５）：５３４－５３６．［４］宋会臻．难以避免的医疗意外与对策探讨［Ｊ］．中国误诊学杂志，２００７，７（９）：２０２８－２０２９．（２０１５－０１－０３收稿）吞、胞饮等作用，将抗原摄取进入细胞内，进而完成对抗原的加工处理过程．同时进一步诱导树突状细胞成熟，成熟的树突状细胞对抗原的摄取、加工能力较弱，但能发挥抗原递呈作用，将处理的抗原，递呈给Ｔ淋巴细胞，同时通过一系列共刺激分子、细胞因子等作用，诱导Ｔ淋巴细胞活化．模式抗原卵白蛋白（ＯＶＡ）有良好的免疫原性，是常用的半抗原载体，用用荧光标记的ＦＩＴＣ－ＯＶＡ抗原，能较好的反应树突细胞摄取、加工抗原吞噬能力，在共聚焦显微镜下观察细胞内ＯＶＡ分布、密度状况，可作为树突状细胞成熟能力鉴别方法之一．目前对于人体树突状细胞研究已有大量报道，引起自身的特性，对树突状细胞的研究具有重要的临床意义．Ｇｉｌｉｅｔ等早期发现，在人体血液及组织中有两种特怔性的树突状细胞组群：髓样树突状细胞（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｙｅｌｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｍＤＣ）以及类浆细胞样树突状细胞（ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｐＤＣ），外周血中ｐＤＣ的比例较ｍＤＣ明显较高时，可诱导出现机体出现免疫耐受［８］．在未来的发展趋势中，树突状细胞将在肿瘤、移植免疫等方面研究中发挥重要的作用．［参考文献］［１］ＷＡＬＬＥＴＭＡ，ＳＥＮＰ，ＴＩＳＣＨＲ．Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｄｅｎ－ｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＣｌｉｎＭｅｄＲｅｓ，２００５，３（３）：１６６－１７５．［２］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵＪ，ＳＴＥＩＮＭＡＮＲＭ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２（１９）：２４５－２５５．［３］高伟生，罗荣成，马树东，等．人外周血树突状细胞的分离与鉴定［Ｊ］．中国组织工程研究与临床康复，２００７，１１（１１）：２１０５－２１０９．［４］陶晓根，莫宝定，陈剑，张蕾，等．健康人外周血树突状细胞体外培养及表型鉴定［Ｊ］．临床和实验－医学杂志，２０１２，１１（２３）：１８３７－１８３９．［５］ＢＡＮＣＨＥＲＥＡＵ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２０００，１８（４）：７６７－８１１．［６］ＫＡＷＡＩＴ，ＡＫＩＲＡＳ．ＴＬＲｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｆ－ｆｅｒ，２００６，１３（６）：８１６－８２５．［７］ＲＥＩＳＥＳＯＵＳＡ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎａｍａｔｕｒｅａｇｅ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，２００６，６（６）：４７６－４８３．［８］ＧＩＬＩＥＴＭ，ＬＩＵＹＪ．ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎＣＤ８ＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｐｒｉｍｅＩＬ－１０ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＴｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｃｅｌｌｓｂｙｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＪＥｘｐＭｅｄ，２００７，２０４（１５）：１０５－１６１．（２０１５－０１－１３收稿）第３６卷44昆明医科大学学报4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444（上接第３７页码）。
dc疫苗 培养流程
dc疫苗培养流程DC疫苗（Dendritic Cell Vaccine）是一种新型的癌症免疫治疗方法，通过培养和激活患者自身的树突状细胞（Dendritic Cell），提高免疫系统对癌细胞的识别和攻击能力。
本文将从DC疫苗的培养流程进行介绍，以便更好地了解这一治疗方法的原理和操作过程。
培养DC疫苗需要一定数量和质量的树突状细胞。
树突状细胞是一类具有强大抗原递呈功能的免疫细胞，其主要任务是捕获、处理和呈递抗原，激活T细胞的免疫应答。
通常情况下，我们会从患者的外周血或骨髓中采集到单个核细胞（Mononuclear Cell，MNC），然后通过负选择或正选择的方法分离出树突状细胞。
接下来，我们需要对分离得到的树突状细胞进行培养和激活。
首先，将树突状细胞放入含有足够营养物质的培养基中，提供细胞所需的生长因子和营养物质，使其能够生长和增殖。
同时，还需要添加一定浓度的肿瘤抗原或抗原肽，以激活树突状细胞对抗原的识别和处理能力。
在培养过程中，通过调整培养条件和添加适当的激活因子，可以促使树突状细胞发生成熟和激活的变化。
成熟的树突状细胞具有更强的抗原递呈能力和免疫刺激能力，能够更有效地激活T细胞的免疫应答。
因此，在培养过程中，我们需要对树突状细胞进行适时的激活和刺激，以提高其成熟度和免疫活性。
为了增强DC疫苗的抗原递呈和免疫活性，还可以通过基因工程技术对树突状细胞进行改良。
例如，可以将特定抗原基因导入树突状细胞中，使其能够表达和呈递特定抗原，从而增强免疫应答的特异性和强度。
此外，还可以通过转染特定基因或抑制特定信号通路，调控树突状细胞的功能和活性。
在完成树突状细胞的培养和激活后，我们需要将其注射回患者体内，以触发免疫应答并抑制肿瘤的生长。
通常情况下，DC疫苗会与其他治疗方法（如放疗、化疗或免疫检查点抑制剂）联合应用，以增强治疗效果并降低肿瘤的耐药性。
总结起来，DC疫苗的培养流程包括树突状细胞的采集、分离、培养和激活。
树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用
树突状细胞的体外培养及其诱导的抗肿瘤免疫作用树突状细胞的体外培养主要通过分离外周血单核细胞（PBMCs）或骨髓细胞，经过不同的培养条件，使其分化成树突状细胞。
一种常用的方法是使用人造蛋白质GM-CSF和IL-4使PBMCs分化为树突状细胞。
此外，使用细胞因子如TNF-α和IL-1β也可以促进树突状细胞的分化。
通过培养条件的调控，可以获得成熟的树突状细胞，以及具有抗原递呈和免疫调节功能的活化状态。
经过体外培养的树突状细胞可以被用于诱导抗肿瘤免疫作用。
树突状细胞具有特异性抗原递呈的能力，可以对采集的肿瘤抗原进行处理和递呈给T细胞，从而激活T细胞的抗肿瘤免疫应答。
研究表明，经过树突状细胞处理的肿瘤抗原能够激活肿瘤特异性T细胞，增强T细胞的杀伤活性，从而抑制肿瘤生长和扩散。
此外，树突状细胞还可以通过诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的产生来增强抗肿瘤免疫。
树突状细胞经过处理后，可以递呈肿瘤相关抗原给T细胞，从而激活和扩增CTL。
这些CTL具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力，从而对肿瘤产生直接的抗肿瘤作用。
研究表明，经过树突状细胞处理的肿瘤细胞可以显著增加CTL的活性，抑制肿瘤生长和扩散。
此外，树突状细胞还可以通过刺激NK细胞的活性来增强抗肿瘤免疫。
研究发现，树突状细胞可以分泌细胞因子，如IL-12和IL-15，这些细胞因子可以激活NK细胞的活性，并促进其对肿瘤细胞的杀伤作用。
此外，树突状细胞还可以通过递呈肿瘤相关抗原给NK细胞，增强其对肿瘤细胞的识别和杀伤能力。
因此，通过刺激NK细胞的活性，树突状细胞可以对肿瘤产生直接的抗肿瘤作用。
综上所述，树突状细胞的体外培养技术提供了一种重要的方法来诱导抗肿瘤免疫作用。
通过处理肿瘤抗原并递呈给T细胞、CTL和NK细胞，树突状细胞能够激活并增强这些免疫细胞的活性，从而抑制肿瘤生长和扩散。
因此，树突状细胞体外培养技术对于发展抗肿瘤免疫治疗具有重要的意义。
进一步的研究和应用将继续推动这一领域的发展，为抗肿瘤治疗提供更多的选择和希望。
骨髓原代树突状细胞培养
骨髓原代树突状细胞培养一、什么是骨髓原代树突状细胞呢？这骨髓原代树突状细胞啊，可是一种超级重要的细胞呢。
它在咱们的免疫系统里就像个小卫士一样。
从骨髓里把它弄出来培养，就像是把一个潜力股挖掘出来，然后精心培育，希望它能发挥出强大的免疫功能。
二、培养的前期准备。
1. 骨髓来源。
咱们得先有骨髓啊。
这骨髓的来源可就有点讲究了。
一般来说，可以从实验动物的骨髓获取，像小鼠就是很常用的。
不过在获取的时候，一定要按照规定的操作流程来，要保证动物的福利，不能随随便便就把骨髓弄出来。
这就好比咱们去摘果子，也得按照正确的方法摘，不能把果树都给毁了。
2. 培养设备和试剂。
培养细胞可离不开那些瓶瓶罐罐的设备和各种各样的试剂。
像培养皿啦，细胞培养液啦，还有各种营养因子之类的。
这些东西就像是给树突状细胞准备的食物和住所一样。
培养液得是专门适合树突状细胞生长的，营养因子也得加得恰到好处，多了少了都不行。
就像我们做饭，盐放多了放少了那味道都不对。
三、培养过程。
1. 分离骨髓细胞。
首先得把骨髓细胞从骨髓里分离出来。
这就像是从一群小伙伴里把咱们想要的那几个挑出来一样。
这个过程得特别小心，手法要轻柔，不能把细胞给弄伤了。
要是把细胞弄伤了，那就像把小幼苗的根给弄断了，它可就长不好了。
2. 诱导分化。
把骨髓细胞分离出来之后呢，就要想办法让它们分化成树突状细胞。
这个时候就得靠那些神奇的诱导因子啦。
就像给种子施魔法一样，让它们朝着树突状细胞的方向发展。
这个过程需要不断地观察，看看细胞有没有按照咱们的期望在变化。
要是发现有什么不对的地方，就得赶紧调整培养的条件，就像调整小幼苗的生长环境一样。
3. 细胞培养的环境条件。
温度、湿度还有二氧化碳的浓度这些环境条件对树突状细胞的培养可重要了。
温度得保持在合适的范围，就像我们人感觉舒适的温度一样。
湿度也不能太干或者太湿，二氧化碳浓度也得刚刚好。
这就好像是给树突状细胞创造了一个最舒适的小窝，让它们能茁壮成长。
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2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养
1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。
RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。
3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。
4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。
5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。
6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。
7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。
8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。
9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。
10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。
11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。
收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。
加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。
Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。
送第四军医大学流式细胞室上机检测。