树突状细胞培养方法

2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养
1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。

2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。

RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。

3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。

4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。

5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。

6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。

7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。

8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。

9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。

10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。

11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。

收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。

加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。

Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。

送第四军医大学流式细胞室上机检测。