柚苷酶及柠檬苦素酶

柚苷酶及柠檬苦素酶
一、柑橘中的苦味物质
柑橘类果实的苦味物质主要有以柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等为代表的黄烷酮糖苷类化合物和以柠檬苦素、诺米林等为代表的三萜系化合物的衍生物—柠檬苦素类似物。

1、柚皮苷的结构和分布
柚皮苷(Naringin)是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑橘苷、异橙皮苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖(2→1)-α-L-鼠李糖，分子式C27H32O14，分子量580.55，其结构式如图1所示。

图 1- 1柚皮苷的结构式
主要存在于芸香科植物柚(Pummelo,Citrus,grandis)、葡萄柚(Grapefruit，Citrus paradisi)、酸橙(Sour orange,Citrus aurantium)及其变种的果皮和果实中，以及枳实、枳壳、骨碎补、化橘红等中草药中。

普通柚果汁中柚皮苷含量为40-138 ppm，葡萄柚汁中柚皮苷含量为136-362 ppm，枳实、枳壳及化橘红中柚皮苷含量分别为1.87-22.72%和0.3-29.2%，因产地、品种、原料成熟度不同而异。

骨碎补中柚皮苷含量为0.3-1.5%。

此外，枸桔果实及叶、梧桐科植物球穗千斤拔叶、唇形科植物牛至以及蕨类植物如Ceterach officinarum 和铁线蕨属的一些种类组织中也含有柚皮苷，但这些植物中柚皮苷的含量较低。

柚皮苷在蒸馏水中苦味阀值为20 mg/L，在果汁中约为30 mg/L。

其溶解度随含糖量的增加而升高，随pH值的升高而降低，在没有成熟的柑橘果实中柚皮苷含量最多。

2 柠檬苦素类似物
2.1柠檬苦素类似物的结构和分布
柠檬苦素类似物又称类柠檬苦素(Limonoids），是一类具有呋喃环的三萜类化合物。

类柠檬苦素具有高度氧化的三萜醇类诱导体结构，与C-17位的呋喃结合，形成C-3位或者C-6位的内脂环，具有C-14、C-15位向的环氧化物特征，主要以游离苷元和配糖体两种形式存在，见图2。

图2 柠檬苦素类似物及配糖体的结构
类柠檬苦素游离苷元不仅水溶性差，而且味苦，是大多数柑橘类水果苦味物质之一，也是使果汁及其他加工制成品产生“后苦味”的物质。

现已从柑橘类中分离得到38种类柠檬苦素苷元，较常见的主要有柠檬苦素(Limonin)、诺米林(Nomilin)、宜昌根辛(Ichangensin)、脱乙酰诺米林(Dealcetrylnomilin）、诺米林酸（Nomilin acid）、脱乙酰诺米林酸(Dealcetrylnomilin acid)等，其中柠檬苦素和诺米林具有强烈苦味。

类柠檬苦素配糖体(Limonoids glucoside)是由类柠檬苦素苷元分子D环开环后在C-17的位置上以糖苷键的形式结合一个五碳糖而构成的，是在植物体内经过一系列非常复杂的生化过程而合成的，大多溶于水溶液，在pH2-8范围内比较稳定，无苦味，且仍保留与其相应的苷元相似的生理活性。

一般情况下，有多少种类柠檬苦素，就该有相应数量的配糖体，但目前从柑橘中只分离出了22种类柠檬苦素配糖体。

柠檬苦素类似物是三萜的一种高度氧化型衍生物，柑橘属中发现有60余种柠檬苦素的甙元及甙，是芳香科橘属植物如橘、柠檬的种子及果汁中的强苦味成分。

目前已从柑橘类中分离得到38种柠檬苦素类似物，其中酸性15种，中性23种，已经证实柠檬苦素、诺米林素等具有抗癌活性和抗肿瘤特性。

酸性类柠檬苦素仅占总配基的20%左右，可溶于水溶液，除个别外都不呈苦味。

而中性类柠檬苦素例如柠檬苦素、诺米林不大溶于水且大都呈苦味。

类柠檬苦素主要存在于果实中，而在茎、叶等组织中含量较少。

在幼果中，类柠檬苦素多以苷元等形式存在，随着果实不断发育，苷元逐步转化为配糖体，作为一种贮存形式存在于成熟果实中。

几乎所有的柑橘果实都是以种子含量最高，其次为果皮，在果汁中含量最低。

种子中的类柠檬苦素苷元含量通常要高于其配糖体，比例大概为2.2:1，而在果实中其比例为1:150。

柑橘中的柠檬苦素类似物以柠檬苦素和诺米林为主要，诺米林因含量很低，对苦味影响赶不上柠檬苦素，故目前研究仍以柠檬苦素为主。

柠檬苦素苦味阀值很低，水溶液中1.0 mg/L，橙汁中3.4 mg/L，60%的人能感觉到苦味。

2.2 柠檬苦素呈苦机理
在果实成熟期间，柠檬苦素可在一些酶的作用下转化为相应的糖苷而不呈苦味，故柠檬苦素含量随着柑橘果实的成熟而有所降低。

在采收时，一般糖苷含量
大于柠檬苦素，而感觉不到苦味。

其实，柑橘中柠檬苦素的前驱物-A 环内酯柠碱酸盐是没有苦味的，但压榨后变成具有强烈苦味的柠檬苦素。

这就形成了榨汁“延迟苦味”(Delayed bitterness)现象。

其机理为A 、D 的内酯环开闭决定苦味的产生，D 环闭环型（柠檬苦素）有苦味，而开环型A 环内酯没有苦味。

当压榨时，在酸性条件下，柠檬苦素前体物质柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素D-环内酯水解酶作用下，转化为柠檬苦素，而使果汁呈后苦味。

图 3 柠檬苦素呈苦机理
二、酶法脱苦
目前，柑橘汁脱苦问题的研究热点集中在生物酶法脱苦上。

酶法脱苦具有专一性强、对柑橘果汁风味和营养成分无破坏、效果好、成本低等特点，是目前较为理想的脱苦方法。

酶法脱苦主要是通过不同的微生物或酶来降解苦味成分柚皮苷和柠檬苦素，生成不含苦味的物质。

柚皮苷酶是针对降解柚皮苷的酶。

它是由α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)组成的一个酶系，是一种胞外酶，最适pH 3.5左右。

柚皮苷首先被a-L-鼠李糖苷酶水解成略有涩味但无苦味的樱桃苷(Prunin)和鼠李糖(Rhamnose )，樱桃苷(Prunin)的苦味是柚皮苷的1/3，苦味有所减轻。

然后在樱桃苷(Prunin)在β-D-葡萄糖苷酶的作用下变成无苦味的柚皮素(Naringenin )和葡萄糖(Glucose )。

Naringin
Prunin + Rhamnose
Prunin Naringenin + Glucose
α−L −rhamnosidase β−D −glucosidase
汪钊等人用黑曲霉变异株ZG86进行柚苷酶固体发酵，发酵酶活力达到15000 u/g豆饼粉，利用此酶对柑橘果汁脱苦，可使柚皮苷含量大幅下降，苦味脱除率达90%。

同时发现pH为3.6~4.6时脱苦效果较好，而一般柑橘果汁的自然pH为3.6左右，因此脱苦时可以不调节pH。

何晋浙等脱除果醋中苦味，在发酵温度25- 28 ℃，酸度在0.5-0.8 g/mL，柚苷酶加量在15 u/mL时，柚苷酶有较佳的活性，酒精度为6.0%-8.0%时，有利于醋酸发酵，制得的果醋基本无苦味。

单杨等研究用复合酶制剂Naringinase和Sumizyme C对柑橘发酵酒的最佳脱苦条件是温度50 ℃，pH 4.0，Naringinase和Sumizyme C各加0.1%，溶解保温2 h，感官评价效果较好。

A.C.Olson等把酶固定于中空纤维上脱除柑橘汁中的柚皮苷；Ono把柚苷酶固定于纤维素酯上脱去柚皮苷。

刘虎成等以AS1.14为菌种，采用K-角叉胶进行包埋，在25℃,摇床转速150 r/min，添加1%乙醇于液体培养基中，在此条件下脱苦率达58.3%；固定化细胞生物反应器在流速2 mL/min处理柑橘汁后基本无苦味，pH从3.8下降到3.7，维生素C损失8%，可溶性固形物损失7%。

每次处理柑橘汁120 mL，可连续使用11次，脱苦率仍达51.08%。

徐仲伟等人采用150 u和180 u的固定化柚苷酶水解柚皮苷，苦味脱除率分别为41.0%和49.7%，并且该固定化酶比自然酶具有更广泛的pH和温度适应范围，以及较高的热稳定性。

同时他们发现，柑橘果汁用固定化酶脱苦处理后，未产生任何异味。

2004年王鸿飞等实验研究发现，在pH值为4、温度为60 ℃、柚苷酶用量0.5 g/L、作用90 min对柑橘果汁进行脱苦，脱苦率为90.55%。

但由于柑橘类果实品种繁多，所含苦味成分及其含量不尽相同，苦味有轻有重，对于不同品种的柑橘类果汁用柚皮苷酶脱苦其效果是有差异的。

因此，用柚皮苷酶对不同柑橘类果汁的脱苦，还有待于进一步研究。

柠檬苦素的脱除可利用柠檬苦素脱氢酶、柠檬苦素裂解酶、柠檬苦素脱氧酶、诺米啉脱氢酶和诺米啉脱氧酶等。

该类酶可使柠檬苦素D-环内酯开环产生无苦味的柠檬苦素衍生物，但它只是一种权宜之法，因为在果汁天然的酸性环境中(pH3.0-3.5)，D环可以重新关闭。

但若使用柠檬苦素脱氢酶打开D环，则可以使柠檬苦素D-环内酯转化为无苦味的A-环内酯，这是一种有效的脱苦方法，但此法还未用于生产。

早在1981年，Vaks等从土壤中筛选出不动杆菌(Acinetobacter sp.)，发现该菌能将柠碱转化为脱氧柠碱，继而转化为脱氧柠酸而达到脱苦的目的。

1983至1985年间，Hasegawa等先后将球形节杆菌、球形节杆菌Ⅱ、棒状杆菌固定于丙烯酰胺上，用于柑橘汁的脱苦，对柠檬苦素和诺米林的脱除效果好。

后来他又发现假单胞菌p.321-18能诱导产生两种酶，即柠碱盐脱氢酶和脱氧柠碱水解酶，最
适pH8.0左右，能将果汁中柠碱水解为柠碱盐A-环内酯，从而降低了果汁中柠碱的含量。

现在己有采用聚丙酰胺凝胶固定球形节杆菌(A.globiformis)用于脐橙汁脱苦，能有效的将柠碱和诺米林转变为非苦味物质，而对果汁其他成分几乎不产生影响。

1988年，Hasegawa发现某些种类的柑橘中存在类柠檬苦素-UDP-葡萄糖转移酶，它将类柠檬苦素上连接一个葡萄糖而将柠檬苦素转化为不苦的类柠檬苦素葡萄糖苷。

1995年，Hasegawa找到了编码类柠檬苦素-UDP-葡萄糖转移酶的基因，他们准备利用基因工程将该基因引入柑橘细胞中，希望达到自然脱苦。

1997年，Hasegawa从脐橙白皮层得到粗蛋白，经过40%-80%硫酸铵盐析，DEAE 离子交换柱层析，得到柠碱葡萄糖苷转移酶，该酶可同时催化柠碱和诺米林两者的糖苷的生成。

罗水忠等人探讨了乳酸菌对常山胡柚果汁中柠檬苦素的降解性能，从多种菌株中筛选到一株链球菌属乳酸菌，在培养48 h后对胡柚果汁柠檬苦素降解率达66.7%。

汪钊等人进行了柑橘果醋加工中柠檬苦素的微生物酶降解研究，微生物酶在pH 7.0、作用温度为40 ℃的条件下，发酵后的果醋其柠檬苦素降低率达55.6%。

醋酸杆菌AS1.41是食品工业上常用菌种，安全无毒，常用于生产食醋。

罗自生等人将醋酸杆菌AS1.01，AS1.41，AS1.44，AS1.216四个菌株对柑橘汁柠碱的脱苦进行比较，研究发现AS1.41效果最好。

在温度25 ℃，150 rpm转速下，脱苦率可达58.3%。

其作用机制未见探讨。

三、产酶菌株筛选及分离。