柚苷酶及柠檬苦素酶

柚苷酶及柠檬苦素酶

一、柑橘中的苦味物质

柑橘类果实的苦味物质主要有以柚皮苷、新橙皮苷、枸杞苷等为代表的黄烷酮糖苷类化合物和以柠檬苦素、诺米林等为代表的三萜系化合物的衍生物—柠檬苦素类似物。

1、柚皮苷的结构和分布

柚皮苷(Naringin)是一种二氢黄酮类化合物，它又称柚苷、柑橘苷、异橙皮苷、柚皮素-7-O-新橙皮糖苷，学名为柚皮素-7-β-D-葡萄糖(2→1)-α-L-鼠李糖，分子式C27H32O14，分子量580.55，其结构式如图1所示。

图 1- 1柚皮苷的结构式

主要存在于芸香科植物柚(Pummelo,Citrus,grandis)、葡萄柚(Grapefruit，Citrus paradisi)、酸橙(Sour orange,Citrus aurantium)及其变种的果皮和果实中，以及枳实、枳壳、骨碎补、化橘红等中草药中。普通柚果汁中柚皮苷含量为40-138 ppm，葡萄柚汁中柚皮苷含量为136-362 ppm，枳实、枳壳及化橘红中柚皮苷含量分别为1.87-22.72%和0.3-29.2%，因产地、品种、原料成熟度不同而异。骨碎补中柚皮苷含量为0.3-1.5%。此外，枸桔果实及叶、梧桐科植物球穗千斤拔叶、唇形科植物牛至以及蕨类植物如Ceterach officinarum 和铁线蕨属的一些种类组织中也含有柚皮苷，但这些植物中柚皮苷的含量较低。柚皮苷在蒸馏水中苦味阀值为20 mg/L，在果汁中约为30 mg/L。其溶解度随含糖量的增加而升高，随pH值的升高而降低，在没有成熟的柑橘果实中柚皮苷含量最多。

2 柠檬苦素类似物

2.1柠檬苦素类似物的结构和分布

柠檬苦素类似物又称类柠檬苦素(Limonoids），是一类具有呋喃环的三萜类化合物。类柠檬苦素具有高度氧化的三萜醇类诱导体结构，与C-17位的呋喃结合，形成C-3位或者C-6位的内脂环，具有C-14、C-15位向的环氧化物特征，主要以游离苷元和配糖体两种形式存在，见图2。

图2 柠檬苦素类似物及配糖体的结构

类柠檬苦素游离苷元不仅水溶性差，而且味苦，是大多数柑橘类水果苦味物质之一，也是使果汁及其他加工制成品产生“后苦味”的物质。现已从柑橘类中分离得到38种类柠檬苦素苷元，较常见的主要有柠檬苦素(Limonin)、诺米林(Nomilin)、宜昌根辛(Ichangensin)、脱乙酰诺米林(Dealcetrylnomilin）、诺米林酸（Nomilin acid）、脱乙酰诺米林酸(Dealcetrylnomilin acid)等，其中柠檬苦素和诺米林具有强烈苦味。

类柠檬苦素配糖体(Limonoids glucoside)是由类柠檬苦素苷元分子D环开环后在C-17的位置上以糖苷键的形式结合一个五碳糖而构成的，是在植物体内经过一系列非常复杂的生化过程而合成的，大多溶于水溶液，在pH2-8范围内比较稳定，无苦味，且仍保留与其相应的苷元相似的生理活性。一般情况下，有多少种类柠檬苦素，就该有相应数量的配糖体，但目前从柑橘中只分离出了22种类柠檬苦素配糖体。

柠檬苦素类似物是三萜的一种高度氧化型衍生物，柑橘属中发现有60余种柠檬苦素的甙元及甙，是芳香科橘属植物如橘、柠檬的种子及果汁中的强苦味成分。目前已从柑橘类中分离得到38种柠檬苦素类似物，其中酸性15种，中性23种，已经证实柠檬苦素、诺米林素等具有抗癌活性和抗肿瘤特性。酸性类柠檬苦素仅占总配基的20%左右，可溶于水溶液，除个别外都不呈苦味。而中性类柠檬苦素例如柠檬苦素、诺米林不大溶于水且大都呈苦味。

类柠檬苦素主要存在于果实中，而在茎、叶等组织中含量较少。在幼果中，类柠檬苦素多以苷元等形式存在，随着果实不断发育，苷元逐步转化为配糖体，作为一种贮存形式存在于成熟果实中。几乎所有的柑橘果实都是以种子含量最高，其次为果皮，在果汁中含量最低。种子中的类柠檬苦素苷元含量通常要高于其配糖体，比例大概为2.2:1，而在果实中其比例为1:150。

柑橘中的柠檬苦素类似物以柠檬苦素和诺米林为主要，诺米林因含量很低，对苦味影响赶不上柠檬苦素，故目前研究仍以柠檬苦素为主。柠檬苦素苦味阀值很低，水溶液中1.0 mg/L，橙汁中3.4 mg/L，60%的人能感觉到苦味。

2.2 柠檬苦素呈苦机理

在果实成熟期间，柠檬苦素可在一些酶的作用下转化为相应的糖苷而不呈苦味，故柠檬苦素含量随着柑橘果实的成熟而有所降低。在采收时，一般糖苷含量

大于柠檬苦素，而感觉不到苦味。其实，柑橘中柠檬苦素的前驱物-A 环内酯柠碱酸盐是没有苦味的，但压榨后变成具有强烈苦味的柠檬苦素。这就形成了榨汁“延迟苦味”(Delayed bitterness)现象。其机理为A 、D 的内酯环开闭决定苦味的产生，D 环闭环型（柠檬苦素）有苦味，而开环型A 环内酯没有苦味。当压榨时，在酸性条件下，柠檬苦素前体物质柠檬苦素A-环内酯在柠檬苦素D-环内酯水解酶作用下，转化为柠檬苦素，而使果汁呈后苦味。

图 3 柠檬苦素呈苦机理

二、酶法脱苦

目前，柑橘汁脱苦问题的研究热点集中在生物酶法脱苦上。酶法脱苦具有专一性强、对柑橘果汁风味和营养成分无破坏、效果好、成本低等特点，是目前较为理想的脱苦方法。酶法脱苦主要是通过不同的微生物或酶来降解苦味成分柚皮苷和柠檬苦素，生成不含苦味的物质。

柚皮苷酶是针对降解柚皮苷的酶。它是由α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)和β-D-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)组成的一个酶系，是一种胞外酶，最适pH 3.5左右。柚皮苷首先被a-L-鼠李糖苷酶水解成略有涩味但无苦味的樱桃苷(Prunin)和鼠李糖(Rhamnose )，樱桃苷(Prunin)的苦味是柚皮苷的1/3，苦味有所减轻。然后在樱桃苷(Prunin)在β-D-葡萄糖苷酶的作用下变成无苦味的柚皮素(Naringenin )和葡萄糖(Glucose )。

Naringin

Prunin + Rhamnose

Prunin Naringenin + Glucose

α−L −rhamnosidase β−D −glucosidase