脂肪酶产生菌的筛选与分离

脂肪酶产生菌的筛选与分离

姓名：赵倩班级：12生物技术学号：12103179 摘要:近年来随着化石资源的枯竭，能源危机越演越烈，生物柴油作为可再生的绿色能源得到了人们的广泛关注。目前用于制备生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝生物柴油的脂肪酶Novozyme435和假丝酵母、无根根酶和青霉等微生物脂肪酶，还有下面即将介绍的一麻疯树油为主要原料生产生物柴油的脂肪酶。该脂肪酶来自于一种用麻疯树油筛选出的细菌。

关键词:脂肪酶生产菌;筛选;产酶条件

一、脂肪酶及其应用前景

脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，它可以在油——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。在微——水界面上将油脂水解成甘油和脂肪。在微生物及动植物体内普遍存在。目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。脂肪酶广泛运用于食品加工及风味改革、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、化妆、洗涤、医药、能源等领域。

二、材料和方法

1.1试样

麻疯树种子油预处理半年以上的土壤

1.2培养基及试剂

富集培养基(g/L):酵母膏2g ,K

2HPO

4

1 g，MgSO

4

,·7H

2

0 0.1g，(NH

4

)

2

S0

4

1.0g,NaCl 0.5 g，pH 7. 0.

驯化培养基(g/L ): (NH

4)

2

SO

4

, 2.0 g,K

2

HPO

4

1.0 g，K

2

HPO

4

1.0 g，Na

2

HPO

4

1.0g，NaCl 0.5g, MgSO

4,·7H

2

0 0.5 g, pH7.0.

选择性平板培养基(g/L):酵母粉0.5 g , (NH

4)

2

SO

4

0.5 g，KH

2

PO

4

0.3 g，

NaCl 0.5 g，MgSO

4,·7H

2

0 0.2g，琼脂20.0 g,pH7.0.将上述溶液灭菌冷却至60℃

左右加入均质后的2%的三丁酸甘油酯溶液,用紫外灯照射灭菌30 min以上备用.

种子培养基(g/L):蛋白陈10.0 g,酵母膏5g，NaCl 5.0 g.

产酶培养基(g / L):大豆油5.0 g , (NH

4)

2

SO

4

2.0 g，MgSO

4

,·7H

2

0 3.0 g，

K2HPO4 1.0 g,胆汁1. 0 g.

三、脂肪酶产生菌的分离

取6克含经粉碎处理麻疯树种子油预处理半年以上的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡的土壤，与40ml无菌水混合，180r/min震荡 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与 30min，取5ml上清液加到富集培养基中，与30℃ 180r/min培养48h后取15ml转接入 30℃、180r/min培养48h后取15ml 转接入 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3 60ml新鲜的富集培养基中，连续转接3次。将经富集培养的菌液适当稀释后涂布于用麻疯树为唯一碳源的分离培养基上，于35℃培养48h后为唯一碳源的分离培养基上，于35℃培养48h 后挑取透明圈和荧光圈较大的单菌落与营养琼脂培养基划线培养纯化，用无菌牙签接种于Tween80 养基划线培养纯化，用无菌牙签接种于Tween80 平板上35℃培养48h，菌落周围出现模糊晕圈，平板上35℃培养48h，菌落周围出现模糊晕圈，直径较大的菌株酶活性较高。接下来即可摇瓶复筛，扩大培养。

四、脂肪酶的分离纯化

酶的分离纯化书将酶从细胞中或其它酶原料中提取出来，再与杂质分开，从而获得符合研究和使用要求的酶制品过程。主要内容包括细胞破碎，酶的提取，离心分离，过滤与膜分离，沉淀分离，层析分离，电泳分裂，萃取分离，浓缩，干燥和结晶等。酶的纯化策略的选择首先要考虑的是其用途，在实验室研究和临床治疗中所使用的应为高纯度的酶；而工业用途的酶对纯度的要求就不是很严格，但是一定纯度的酶制剂不仅可以保证催化反应快速有效地进行，而且也降低了反应的复杂性，增加了反应的可预测性。大部分微生物脂肪酶为胞外酶，发酵后通过离心或抽滤出去菌体，得到的含酶上清液通过硫酸铵或有机溶剂萃取浓缩，出去部分蛋白质和糖类，然后再用层析法进一步纯化。除了少部分基因工程菌能够高效表达功能性脂肪酶，绝大部分野生型菌株都要联合两种以上的层析方法纯化才能获得预期纯度的蛋白质。

五、酶的固定化

在一定的pH缓冲液中，加入一定量的酶液，搅拌搅拌使在一定的pH缓冲液中，加入一定量的酶液，搅拌搅拌使其充分溶解，选用一定量的吸附载体（石英砂。琼脂粉、 CM-sephsrose、DEAE-sepharose以及phenylCM-sephsrose、DEAE-sepharose以及phenylSepharose)加入酶液中，恒温水浴搅拌一定时间后，

离 Sepharose)加入酶液中，恒温水浴搅拌一定时间后，离心手机固体，将固定化载体用缓冲液洗3~5次，室温下干心手机固体，将固定化载体用缓冲液洗3~5次，室温下干燥。再配制一定浓度的海藻酸钠溶液，向其中加入已吸附了脂肪酶的载体，中速充分搅拌，使之混匀，用微量注射器逐滴滴入到一定浓度20mlCaCl2溶液中，逐滴滴入到一定浓度20ml CaCl2溶液中，4 ℃下固化。

参考文献: [1]马歌丽，高建奇，张志刚，等.根霉脂肪酶产生菌筛选及发酵培养基研究[J].食品工业科技，2006,27(22):12-13.

[2]曾璐，林亲录，王伟.脂肪酶产生菌产酶条件的研究巨[J].现代食品科技，2007, 23(7):15-21.

[3]秦华明.高效油脂降解菌的筛选及其对油脂废水的强化处理研究[I].华南理工大学，2003.