第6章 分子生物学技术

影响复性的因素 ① 单链核酸的起始浓度：浓度越高，复性 越快。
② 核酸链长度：越长，形成配对的难度越 大，复性也慢。
③ 核酸分子的复杂性：复杂性越高，形成 正确配对的难度也越大，复性越慢。
④ 温度：温度过低则分子运动减慢，少 数碱基形成的局部双链也不易解离。 适宜的复性温度是比Tm低25℃。 ⑤ 离子强度：适当的离子强度可中和核 酸分子上磷酸基团所带的负电，减少 双链间的静电斥力，有利于复性。但 离子强度过高也不利于复性。
三、核酸分子杂交信号的检测
放射性同位素标记探针：
放射自显影。
非放射性同位素标记探针：
偶联反应+显色反应。
四、核酸分子杂交技术
固相杂交：结合于某种固相支持物上的待 测样品与溶解于杂交液中的探针进行的杂 交。包括膜上印迹杂交、原位杂交。 液相杂交：待测样品和探针均溶于液体中 进行杂交反应。
5、核酸的储存
DNA： ①溶于pH8.0的TE（tris和EDTA）缓冲液中， 4 ℃或-20 ℃保存； ②长期保存样品中可加入1滴氯仿。
RNA：
①溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70 ℃保存; ②溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液 中，-20 ℃保存。或加1滴0.2 mol/L VRC( 氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70℃。
第六章 分子生物学 基本操作技术
第一节 核酸的提取
第二节 核酸杂交技术
第三节 PCR技术
第一节 核酸的提取
一、提取核酸的基本步骤
（一）总则 保证核酸一级结构的完整性； 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；
核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子； 应尽量去除非目标核酸分子。
品--可得200kb左右的DNA。
3 玻璃棒缠绕法：
用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙 醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，
DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb。
4 异丙醇沉淀法：
基本同1法，仅用二倍容积异丙醇替代
乙醇，可去除小分子RNA（在异丙醇中可溶
状态）。
5 表面活性剂快速制备法：
（二）措施
①温度不要过高；
②控制pH值范围(pH值5-9)；
③保持一定离子强度； ④减少物理因素对核酸的机械剪切力； ⑤所用器械和一些试剂需高温灭菌； ⑥提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸 链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
（三）核酸分子抽提的技术设计
1、核酸的释放--破裂细胞，释放核酸。
二、基因组DNA的分离与纯化
（一）样品准备
• 常见的标本：血液、尿液、唾液、组
织、培养细胞、细菌等。
• 生物组织：最好新鲜组织，若不能马
上提取，应贮存－70℃或液氮中。
（二）DNA提取 1、酚抽提法：
先用 EDTA 、 SDS 、蛋白酶 K 破碎细
胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚
或酚 - 氯仿抽提 DNA ，最后乙醇或异丙醇
• 核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA 或RNA片段上带上可检测的标记，可用 来检测样品中未知的核酸序列。
影响核酸分子杂交的因素
① 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越 高，复性速度越快。但双链探针浓度过 高会增加自我复性而影响杂交；浓度过 高也会增加非特异结合，使杂交背景增 强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越 高，配对难度也增大。
4、核酸的鉴定 ⑴浓度鉴定 浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液--紫外分光 光度法。
DNARNA浓度(μg/ml)=OD260×稀释倍数×5040
低浓度核酸溶液--溴化乙锭荧光光度法。 ⑵纯度鉴定 DNA:OD260/OD280=1.8；OD260/OD230>2.0。 RNA:OD260/OD280=1.7-2.0；OD260/OD230>2.0。 ⑶完整性鉴定--凝胶电泳法
1.5 2.0
0.2-3 0.1-2
（四）DNA的浓缩
1 、固体聚乙二醇（ PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量。 2 、丁醇抽提浓缩： DNA 溶液中水可分配到 正丁醇或仲丁醇，但 DNA 不会。因此重 复几次可显著减少DNA体积。
（六）DNA回收 主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率，去除回 收DNA样品中的污染物。 电泳到DEAE-纤维素膜：500bp-5kb的DNA片 段回收率较好，纯度高。但不适用于分子 量超过10kb和单链DNA。 透析袋电洗脱： 低熔点琼脂糖凝胶：有机溶剂提取法、玻 璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，
此过程称为退火(annealing)。
3、解链温度（融解温度，Tm） (melting temperature)：
使50%的DNA发生变性时的环境温度。
增色效应： DNA变性后对 260nm紫外光 收增加的现象。
减色效应： 变性DNA复性 后对260nm紫 外光吸收减少 的现象。
在某些理化因素的作用下，核酸双链分
子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双
链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结
构被破坏，形成单链分子的过程。 常用的变性方法： ①热变性；②酸碱变性；③化学试剂变性
2、DNA的复性（renaturation)： 在适当条件下，变性DNA的两条互补链
可再恢复成天然的双螺旋结构的过程。
限制片段 琼脂糖电泳 带有DNA片段的凝胶
DNA分子
用缓冲液转移DNA
至膜上（尼龙膜或 硝酸纤维素滤膜） 凝胶 滤膜 转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
Southern 印迹杂交
Northern 杂交 原理：RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分 离后，转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，经 过杂交，分析mRNA的大小及含量。
应用：半定量分析mRNA的含量；确定 mRNA分子的大小。
方法：提取组织细胞总RNA→RNA定量 →变性胶电泳→转膜→干膜→预杂交→杂 交→洗膜→压片→洗片→图像分析
Western印迹杂交
将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并 染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗 原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴 别滤膜上的蛋白质。 斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
（三）液相杂交 1. RNA酶保护分析法
2. 核酸酶S1保护分析法
待测RNA样品 ↓ ←单链DNA探针（M13体系合成） 液相杂交 ↓ DNA-RNA杂交双链 核酸酶S1（专一降解未杂交 ← ↓ 的DNA和RNA单链） 酶解 ↓ 杂交体系纯化 ↓ 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 放射自显影
待测RNA样品 ↓← 单链RNA探针 液相杂交 ↓ RNA-RNA杂交双链 RNA酶（专一降解未 ← ↓ 杂交的RNA单链） 酶解 ↓ 杂交体系纯化 ↓ 脲-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 放射自显影
⑴高速组织捣碎机捣碎 ⑵玻璃匀浆器匀浆 ⑶超声波处理法 ⑷液氮研磨法 ⑸化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） ⑹生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
2、核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸 与其他物质分离 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖 和脂类分子）、非目的核酸分子、试剂 3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后 使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤
② 离子强度：高离子强度溶液中，有利于 杂交分子形成。
③ 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进 行杂交。 ④ 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯 酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而 加速杂交反应。 ⑤ 杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂 交的Tm。含30%—50%甲酰胺的杂交温度能 降低到30—42℃。较低的杂交温度，使探 针更稳定，并能更好地保留非共价结合的 核酸。
4、预杂交
为了减少探针与广泛存在的非互补 核酸的非特异性结合，在杂交前可用封 闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前 的这些处理过程称为预杂交。
常用于预杂交的封闭物 ① 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA 或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后， 除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们 可被吸附到所有其它区域，使整个背景 覆盖一层。由于它们与探针无同源性， 在杂交反应中可大大减少探针的非特异 性结合，使背影清晰。 ② 高分子化合物：某些高分子化合物具有 封闭膜上非特异位点的能力。一般常用 Denhard’t溶液，包含聚乙烯吡咯酮、小 牛血清白蛋白、聚蔗糖。
二、核酸探针
指能与特定核酸序列发生特异性互补 的已知核酸片段。一般而言，核酸探针带 有特殊的标记物。 核酸探针的类型： 寡核苷酸探针、基因组DNA探针、cDNA 探针、RNA探针、单链DNA探针。 常用的探针标记物： 放射性同位素（3H、32P、35S、125I）； 非放射性同位素（生物素、地高辛、辣根 过氧化酶、碱性磷酸酶等）。
Leabharlann Baidu进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。
主要试剂及其作用： EDTA： ①二价金属螯合剂，抑制核酸酶； ②降低细胞膜的稳定性。 SDS： ①溶解膜蛋白和脂肪，使细胞膜破裂； ②溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来； ③对RNA、DNA酶有抑制作用； ④与蛋白质形成复合物，使蛋白质变性。
适于核酸样品定量检测。
（二）原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与 细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法 称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、 RNA-RNA杂交。
取材 ↓ 组织、细胞固定 ↓ 预杂交 ↓ 杂交 ↓ 放射自显影或免疫酶法显色 ↓ 观察结果
菌落杂交法
蛋白酶K： 消化DNA酶和细胞中的蛋白质。可与SDS、 EDTA同时使用，仍保持较高活性。
酚：
使蛋白质变性沉淀，抑制DNA酶活性。
pH8.0的Tris溶液：
使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层 滞留。 酚或酚-氯仿中少许的异戊醇： 减少气泡的产生，利于分相，保持分相的稳 定性。
2 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺 解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。 高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合 物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽 提的步骤。 适用于从标本中制备高分子量的DNA样
第二节 核酸杂交技术
一、核酸分子杂交的基本原理
核酸分子杂交
（nucleic acid hybridization）
指具有互补序列的两条核酸单链在一定 条件下按碱基配对原则形成双链的过程。 不同来源的DNA或RNA单链在一定条件下 重新组成的新的双链分子——杂交分子。
1、DNA的变性(denaturation)：
Tm值与核酸含量的关系 ① <20bp Tm = 4(G≡C)+2(A＝T) ② >20bp Tm = 69.3+0.41(G≡C)%
4、杂交
• 来源不同的两条单链核酸分子通过碱 基互补形成异源双螺旋分子，称为核 酸分子杂交。 • 杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、 DNA与RNA之间的杂交。
第三节 PCR技术
聚合酶链式反应：
在引物指导下由
酶催化的对特定
克隆或基因组
DNA序列进行的
体外扩增反应。
PCR反应的特点
特异性强：引物与模板结合的特异性及
聚合酶的忠实性。
用Triton X-100或NP-40表面活性剂破
碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙 醇沉淀或透析。
（三）DNA样品的纯化 方法：透析、层析、电泳及选择性沉淀。 琼脂糖电泳适用于0.1-60Kb片段，聚丙烯酰 胺（PAGE）电泳适用于5-500bp大小的片段。
琼脂糖含量％（W/V） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 线性DNA分离范围（Kb） 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
（一）膜上印迹杂交 将待测核酸序列结合到一定的支持物 上，然后与存在于液相中的核酸探针进行 杂交的过程称为膜上印迹杂交。 印记的方法：
虹吸印迹法；真空转移法；电转移法
DNA或RNA ↓ 电泳分离核酸片段 ↓ 转移至固相支持物（印迹技术） ↓ 杂交 ↓ 洗去未杂交探针 ↓ 杂交信号检测
限制性酶切割