14.第十四章 细胞增殖调控与癌细胞

G1期周期蛋白降解通过SCF（Skp-cullin-F-box protein）泛素化途径实现。
G1期周期蛋白不含破坏框序列，而含PEST序列， 对G1期周期蛋白降解起促进作用。 参与复制的调控因子，如p21, p27和p57等通过泛素 化途径降解。 SCF具有E3泛素连接酶的功能，由Skp1, Cul1和 Rbx1三种亚基构成。 SCF的底物特异性由F-box蛋白决定。
Cln 1、2 CDK1(CDC28) Clb 5、6 CDK1(CDC28) CDK1(CDC28)
CDK1(CDC Clb 1-4 2)
*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。
(2)不同类型的CDK/cyclin复合物及其参与的细胞周期调控
（2）CDK的分子结构
Leland H. Hartwell
R. Timothy (Tim) Hunt
Sir Paul M. Nurse
cdc28
周期蛋白
cdc2
三、细胞周期蛋白
● 特点：在细胞周期中呈周期性变化。含有一段约
100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介
导与CDK结合。
● 作用：激活和引导CDK作用于不同底物。
实验一
时间 研究者 步 骤
HeLa 细胞
1970 Rao和Johnso
将HeLa细胞同步于不同阶段，然后将M期细胞与其他间期细胞融合
G1期
同步化
S期
早熟染 色体凝缩 仙台病毒介导 （PCC）
M期细胞
G2期
结果 结论
M期细胞可以诱导PCC 在M期细胞中可能存在一种诱导染色体凝集的 因子，称为细胞有丝分裂促进因子。
◆在G1期的后期,APC失活,使得周期蛋白B的浓度升高,同
时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期。
（三）G1/S期转化与G1期周期蛋白依赖性CDK
● G1期，在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与CDK4、 CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb蛋白（成视网膜细胞瘤蛋 白）磷酸化而失活，释放出转录因子E2F，促进许多基因的 转录，如编码cyclinE、A和CDK1的基因。 ● 在G1-S期，cyclinE与CDK2结合，促进细胞进由G1期向S期 转化，并直接参与中心体复制与调控。TGFβ抑制cyclinECDK2的活性使细胞抑制在G1期。CyclinE的抗体能使细胞 停滞于G1期。CDK2催化p107磷酸化，释放E2F。 ● 在S期，cyclinA与CDK2结合为S期的主要激酶，参与DNA 复制，使复制因子RF-A磷酸化而活性增强。
APC种类：15种，如cdc16, cdc23, cdc27和BimE等
APC活性调节：两类 正调控因子：cdc20/Fizzy, cdh1/Fzy等 负调控因子：Emi1, Emi2, Mad2, BubR1等
泛素与周期蛋白的降解： 多聚泛 素化作 用
(polyubiquitination) ●泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)
实验三
时间 1983
以Tim Hunt为代表，由Evans于1983年报道
研究者
步骤
以海胆卵为对象， 对细胞周期的蛋白表达水平进行深入研究 发现2种特殊蛋白质，随细胞周期变化而变化，一般 在间期积累，分裂期消失，命名为周期蛋白（ Cyclin A , Cyclin B） 周期蛋白是进入M期所必须，从酵母到人类各种生物 中均存在，可能参与MPF的调控
第十四章
细胞增殖调控与癌细胞
第一节 细胞增殖调控
本节内容
一 二 三 四 MPF的发现及其作用 p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系 周期蛋白 CDK和CDK抑制因子
五
六
细胞周期运转调控
其他因素在细胞周期调控中的作用
一、MPF的发现及其作用
1 科学家通过三个实验找到
并证实了MPF
2 MPF的功能
降解，完成一个细胞周期。
● M期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称破坏框 (destruction box)。 ● 泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的 蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命
蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。
● 26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白 质分解成短肽。
步骤
结果
结论
第一个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为 34kDa，称为p34cdc2。 特点：突变后芽殖酵母细胞停留在G2/M期
实验二
时间
研究者
1960 Hartwell 以芽殖酵母为实验材料，构建温度敏感 型突变株，分析突变株基因改变情况 找到cdc基因，如cdc28,表达蛋白为 34kDa,称为p34cdc28 第二个被分离出来的cdc基因； 突变后细胞停留在G1/S或G2/M期 。
APC和SCF在细胞周期中的活性及其底物
SCF泛素化依赖蛋白降解途径
DNA复制活动调控
● 复制起始点识别复合物：6个亚基，ORC1-6
● cdc6 和cdc45也是复制所必需的
● “DNA复制执照因子学说”：存在于细胞质中，随 细胞分裂进行，“执照”信号与减弱直到消失。 DNA复制执照因子的本质为Mcm蛋白，分为6种
（二） M期周期蛋白与分裂中期向后期转化
细胞周期运转到分裂中期后，M期周期蛋白 B/A 与CDK1分离，在APC介导下，通过泛素化途 径而降解。 CDK1激酶活性丧失，蛋白质（ CDK1激酶磷 酸化的）去磷酸化，细胞周期由中期向后期转化。
● 在分裂中期，当MPF活性达到最高时，激活后期促进复合 物APC，将泛素连接在cyclin B上，cyclinB被蛋白酶体
● 已知30余种，分为4类：G1型、G1/S型、S型、
M型。
9aa:RXXLGXIXN
40aa:Lys富 集，参与泛素 介导降解
介导周期蛋白与CDK结合
M 期周 期蛋白
G1 期 周期蛋 白
•破坏框：将泛素（遍在蛋白）连接到破坏框上 周期蛋白框：介导与不同CDK结合
PEST序列与G1期周期蛋白更新有关
A： G1期DNA未复制，超前染色体为单线性； B：S期DNA正在复制，超前染色体为点状，很多复制起始点； C：G2期DNA复制完毕，超前染色体为双线性。
实验二 时间 1971 Masui和Markert 用解剖的方法分离非洲爪蟾第IV期卵母细胞， 孕酮诱导成熟后进行细胞质移植实验 孕酮诱导成熟的卵母细胞的细胞质 能诱导其他卵母细胞的成熟
在成熟的卵母细胞中，必定有一种物质，能诱导卵 母细胞成熟，这种物质称为成熟促进因子（MPF）
研究者
步骤
结果
结论
卵细胞细 胞质移植 实验
成熟卵母细胞中 的物质能诱导卵 母细胞成熟
实验三
时间 1988 Maller et al
以爪蟾卵为材料，纯化MPF工作 MPF组成：p32和p45两种蛋白。p32和p45结合后， 表现出蛋白激酶活性，能使多种蛋白质底物磷酸化 MPF（又称细胞促分裂因子或M期促进因子），是由 细胞周期蛋白与周期蛋白依赖性蛋白激酶组成的复 合物，能启动细胞进入M期。
周期。例如：
● 组蛋白H1磷酸化：导致染色体的凝集；
● 核纤层蛋白A、B、C磷酸化：导致核纤层解体、
核膜消失；
● 核仁蛋白磷酸化：导致核仁解体。
2、CDK1激酶活性的调控
● 先决条件：周期蛋白与CDK结合
● 修饰：对一些重要位点进行磷酸化修饰，
对CDK激酶活性起重要调节作用。
CDK1激酶活性的综合调控 （教材p305）
步骤
结果
Baidu Nhomakorabea
结论
cdc2: 第一个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为p34cdc2 特点：突变后裂殖酵母细胞停留在G2/M期
cdc28: 第二个被分离出来的cdc基因，表达蛋白为p34cdc28 特点：突变后芽殖酵母细胞停留在G1/S或G2/M期
共同特点： 1. 大小相等，是同源物，并且与MPF中的P32是同源物 2．本身都不具激酶活性，只有与特定蛋白结合后 （ p56cdc13 ） 才有激酶活性
（1）CDK的种类 （2）CDK的分子结构
● CDK抑制因子
1、CDK
通过PCR技术构建人类、非洲爪蟾、果蝇cDNA文库，并
对其筛选。
分离到10多个cdc2同类基因，不同物种的cdc2基因编 码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合， 将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性。它们被统称为周 期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase)，简称
● G1期周期蛋白：只在G1期表达，只在G1期和S
期转化过程中执行调节功能。
● 种类： cyclin C、D、E、Cln1、Cln2、Cln3
● 举例：
在生长因子的刺激下，cyclin D表达，并与
CDK4、CDK6结合，使下游的蛋白质如Rb磷酸
化，释放转录因子E2F，促进许多基因的转录，
如编码cyclinE、A和CDK1的基因。
证明了周期蛋白B是MPF的另一个成分
结果
结论
与Maller实验 室合作
MPF=p34cdc2(p34cdc28)+ p56cdc13 (cyclinB)
2001 年 10 月 8 日 美 国 人 Leland Hartwell 、 英 国 人 Paul
Nurse 、 Timothy Hunt 因对细胞周期调控机理的研究而 获诺贝尔生理医学奖。
CDK。
已经发现CDK1-CDK13等CDK激酶。
（1）与不同类型的周期蛋白相结合的CDK
激酶复合体
Cyclin G1-CDK G1/S-CDK S-CDK M-CDK Cyclin D* Cyclin E Cyclin A Cyclin B 脊椎动物 CDK CDK4 、6 CDK2 CDK2 Cyclin Cln 3 芽殖酵母 CDK CDK1(CDC28)
● M期周期蛋白：在间期表达和积累，到M期时才
表现出调节功能。
● 种类：cyclinA、cyclinB
● 举例：
cyclinA、cyclinB与CDK1结合，CDK1引
起染色体凝缩、核膜解体等。
不同的周期蛋白与不同的CDK结合， 调节不同的CDK激酶的活性。
四、CDK和CDK抑制因子
● CDK （ cyclin-dependent kinase）
可能与周期蛋白结合有关
不同物种的cdc2基因编码的蛋白质都含有一段相似序列，并且都能和周期蛋白结合， 将其作为调节亚基，进而表现出激酶活性，被统称为CDK。
2、CDKI
CDK抑制因子（CDKI）：对细胞周期起负调控作用，分为：
①INK4家族: p16为典型代表，主要抑制 CDK4和 CDK6活性。
● 周期蛋白B：G1期晚期开始合成，G2期达最大
值。
周期蛋白B含量达到一定程度，CDK1激酶活
性始现，到G2晚期， CDK1激酶活性最大。
（一） G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用
cyclinB在CDK1激酶活性调节中的作用
● CDK1激酶使某些蛋白质磷酸化，改变其下游的
某些蛋白质的结构和启动其功能，实现调控细胞
研究者
步骤 结果
结论
二、p34cdc2激酶的发现及其与MPF的关系
1
酵母中cdc基因的发现
2
cdc激酶与MPF的关系
实验一
时间 研究者 1970
Nurse等
以裂殖酵母为实验材料，构建温度敏感型突 变株，分析突变株基因改变情况 找到cdc基因，如cdc2,表达蛋白为34kDa, 称为p34cdc2
S期检验点： DNA复制是否完成？ G2/M检验点：
检查DNA是否损伤？
细胞体积是否足够大？
中-后期检验点 （纺锤体组装检验点）
cell cycle regulation
（一） G2/M期转化与CDK1激酶的关键性调控作用 1、CDK1激酶
● Cdc2蛋白：在细胞周期中，含量相对稳定。
②Cip/Kip家族：p21为典型代表，主要对G1期CDK（ CDK2、
CDK3 、 CDK4 和 CDK6 ）起抑制作用。还能与 DNA 聚合 酶δ的辅助因子PCNA结合，直接抑制DNA的合成。
五、细胞周期运转调控
细胞周期中的检验点
G1/S检验点： 检查DNA是否损伤？ 细胞外环境是否适宜？ 细胞体积是否足够大？
●泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) ●泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3)
APC的活性调节控制周期蛋白B的降解
◆当 MPF 的活性在有丝分裂中期达到最高峰时 , 它被
CDK所激活，即APC磷酸化后被激活；
◆接着发生周期蛋白B遍在蛋白多聚化, 引起周期蛋白B的 降解； ◆由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必 导致MPF的失活；