第二章固液分离和细胞破碎案例

1. 离心分离
在液相非均一系统中，利用离心力达到液-液、液固、液-液-固分离的方法，统称为离心分离。
优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好； 缺点：设备投资高、能耗大。 离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式 离心机。
离心分离因数
重量 kg
f=
Gu2
gR
=
G
(2πRn)2 60
gR
2 2 GRn GDn = = 900 1800
旋转 直径
离心分离因数：又称为离心力强度，表示 在离心机中产生的离心加速度与自由下降 的加速度之比。
转速 r/min
2. 过滤
微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片 以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进 行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快、滤液澄清，并且有 高的收率。
B. 常用过滤设备
(1) 板框压滤机
广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母 菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量 1-10%的悬浮液的分离。 优点:过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，
对不同过滤特性的发酵液适应性强。 缺点:不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条 件差，非过滤的辅助时间较长。
硫酸亚铁 FeSO4· 7H2O
石灰；ZnSO4；MgCO3
（2）絮凝
•絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相 对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结 构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷 的阴离子（如---COOH）或阳离子（如---NH2） 基团以及不带电荷的非离子型基团。 •它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面。 •当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不 同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较 大的絮团，这就是絮凝作用。
滤饼过滤：
过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、金属织布、玻璃纤 维纸、合成纤维等无纺布。当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤 布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。当滤饼至一定厚度时即起过滤 作用，此时即可获得澄清的滤液，这种方法叫做滤饼过滤，在滤 饼过滤中，悬浮液本身形成的滤饼起着主要的过滤作用，适合于 固体含量大于0.1g/100ml的悬浮液的过滤分离。
发酵液预处理的方法：
加热法 调整pH 凝聚与絮凝
使用惰性助滤剂
加入反应剂
1.加热法
最简单和价廉的预处理方法，即将悬浮液加 热到所需温度并保温适当时间。 可有效降低悬浮液的黏度，并加速聚集作用 以去除某些杂蛋白；降低悬浮液的最终体积，
2.调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和 电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。 在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜 发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的 电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细 胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可 能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的 进行。
第三节 细胞破碎方法
破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百 分数。
N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。 N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。
3.2 细胞破碎理论
1)、细胞破碎
A 压撞 破膜 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁
3.3 细胞破碎方法
细胞破碎法
机械破碎法
超声波法 高压匀浆机 组织捣碎机 细菌磨 珠磨法
第二章
固液分离和细胞破碎
目的
不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎 片、核酸和蛋白质的沉淀物）， 还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以 利于后继各步操作。
采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子
的大小，提高其沉降速度；
或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。
第一节
③ 加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。
不足之处
a. 加热法只适合于对热较稳定的目的产物； b. 极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消 耗大量酸碱； c. 有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较 少的场合。
3. 吸附法
加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。 例如： ① 在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的 协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附 蛋白质；
3.凝聚与絮凝
采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片 及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大 的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地 除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。
凝聚——指在投加的化学物质（如铝、铁的盐类 或石灰等）作用下，胶体 脱稳并使粒子相互聚集 成1mm大小块状凝聚体的过程。
(一) 高价无机离子的去除方法
1) Ca2+ ——草酸、草酸钠，→形成草酸 钙沉淀（注意回收草酸） ；
2) Mg2+——三聚磷酸钠，→形成三聚磷 酸钠镁可溶性络合物； 3) Fe3+ ——黄血盐(亚铁氰化钾)，→普鲁 士兰沉淀
(二) 杂蛋白的去除方法 1. 沉淀法
蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。 在酸性溶液中带正电荷； 在碱性溶液中带负电荷。 在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为
2）双水相萃取
向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二 醇等）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物， 重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某 种高分子化合物的目的。
3）吸附法
向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片 悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。 主要的问题是很难选择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附 而损失。
悬浮液以较高速度沿切线方向进入旋风分离器， 轻相由分离器中央排出， 重相由分离器下部排出， 但不适合直径<5 μm颗粒去除（可用丝网分离器）。 霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用 过滤方法； D.介质过滤 细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采 工业上常用 用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可 E.离心 用过滤进行固液分离。
单元组成 板 布 板 布 板
操作注意点
尽量使工作时间和辅助时间接近； 降低滤液粘度
(2) 真空转鼓过滤机
1）切向流过滤,又称错流过滤
交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。 其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的 剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。
3. 其他固液分离方法
物理破碎法
反复冻融法 渗透压冲击法 冷热变替法
化学破碎法
有机溶媒法 自溶法 酶法
超声波破碎
超声波破碎原理：超声波作用下液体发生空穴化作用，产 生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 超声空化：存在于液体中的微小气泡（空化核）在超声场的 作用下振动、生长并不断聚集声场能量，当能量达到某个阈 值时，空化气泡急剧崩溃闭合的过程。
等电点。
1) 酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉 淀。
• 在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子，如三氯 乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸 盐、过氯酸盐等形成沉淀； 在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，如Ag+、 Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。
•
2. 变性法
① 加热，
② 大幅度调节pH值，
A. 根据过滤机理和操作可分为澄清过滤和滤饼过滤 澄清过滤：
过滤介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，当 悬浮液通过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使 滤液得以澄清，适合于固体含量少于0.1g/100ml、颗粒直径在 5-100um的悬浮液的过滤分离，如河水、麦芽汁、酒类和饮料 等的澄清。
絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥 架作用，使胶体颗粒交联成网，形成10mm大小 絮凝团的过程。
（1）凝聚
发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电 层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。
阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为： Al3+ >Fe3+ >H+ >Ca2+ >Mg2+ >K+ >Na+ >Li+ 常用的凝聚剂电解质有： 硫酸铝 Al2(SO4)3•18H2O(明矾) 氯化铝 AlCl3•6H2O 三氯化铁 FeCl3
② 在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二 钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及 其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。
第二节
固液分离工程及设备
一、固液分离的方法
A.重力沉降
B.浮选
通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。 用于固液比重差小、直径5～30μm颗粒的分离，污水处理
C.旋液分离
③ 固体粒子可压缩性大；
④ 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑤ 性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生 物污染、蛋白酶水解等作用的影响。
预处理的目的
（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液 中分离固形物的速度，提高固液分离器的效率； （2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相 中（多数为液相）； （3）除去发酵液中的部分杂质，以利于后续 各步操作。
5.加入反应剂
加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶 性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防 止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身 可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改 善过滤性能。 如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化 为单糖，以提高过滤速率；
如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入 0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5% 硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。
二、发酵液的相对纯化 发酵液中的杂质
高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+）
杂蛋白
在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和 吸附能力， 在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使 两相分离不清。
在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染， 影响过滤效率。
在预处理时，应尽量除去这些物质。
（3）混凝
•对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子 型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和 产生吸附桥架的双重机理；
•对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用 凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包 括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。
4.加入助滤剂
一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速 增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤 剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。 常用的助滤剂有： 硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、 炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。 使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m3；中等 粒度用量为700 g/m3；粗粒用量为700-1000 g/m3。
工业上使用的絮凝剂可分为三类：
1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚 苯乙烯类衍生物； 2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等； 3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻 酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。
目前最常见的高分子聚合物絮凝剂：
有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物
发酵液的预处理
一、发酵液过滤特性的改变 培养液的组成：
水70-80% +
固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+
少量的代谢成物 + 细胞破裂后的内容物 + 残存的培养基成分
微生物发酵液的特性为：
① 发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部 分是水； ② 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；
根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类： ① 非离子型、 ② 阴离子型（含有羧基） ③ 阳离子型（含有胺基）
聚丙烯酰胺类Biblioteka Baidu凝剂的优点
• • • • 用量少，一般以mg/L计量； 絮凝体粗大，分离效果好； 絮凝速度快； 种类多，适用范围广。
聚丙烯酰胺类絮凝剂的缺点
存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯 酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。
优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面 张力、液体体积和流速、探头材料和形状； B、超声产生超氧离子毒害作用； C、有效能量的利用率低；
D、产热大，需控温；
E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞 破碎。
高压匀浆破碎
高压匀浆破碎原理：主要利用 细胞悬液在高压作用下液相 剪切力以及细胞与固定表面 的撞击力而使之破碎。 特点：适用于酵母和大多数细菌细胞的破碎，不宜 用于团状或丝状菌的破碎；由于操作中温度会 升 高，需对料液作冷却处理，保护目的产物活性。