反射模式与线性模式MALDI-TOF MS联合分析荔枝果核缩合单宁

2011年第69卷化学学报V ol. 69, 2011第24期, 2981～2986 ACTA CHIMICA SINICA No. 24, 2981～2986

* E-mail: zhouhc2010@

Received April 17, 2011; revised July 31, 2011; accepted October 11, 2011.

教育部新世纪优秀人才支持计划(No. NCET-07-0725)和国家自然科学基金(No. 31070522)资助项目.

2982化学学报V ol. 69, 2011

色素[1]. 依据聚合度大小可分为单体(Monomeric)、低聚(Oligomeric)和高聚(Polymeric)原花色素[4]. 因此, 不同的结构单元、连接方式和聚合度的异质性是缩合单宁结构多样性的化学基础. 近年来, 不断有关于植物缩合单宁原花色素生理学和药理学活性的研究报道[5～7]. 同时, 植物缩合单宁的生态功能引起了不少研究者的关注[8,9]. 鉴于结构的复杂多样性, 对其结构进行准确地分析成为研究缩合单宁生理活性和生态功能的先决条件.

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI- TOF MS)是20世纪80年代末发展起来的一种重要的软离子化质谱技术, 被广泛地应用到生物和材料相关领域的研究中[5,10,11]. 自1997年Ohnishi-Kameyama等[12]将MALDI-TOF MS应用于研究植物单宁以来, MALDI- TOF MS被证实了是一种较为理想的分析多分散植物单宁聚合物的质谱技术[13～15]. 在近十几年的研究中, 反射模式(Reflectron modes)与线性模式(Linear modes)都被广泛应用于植物缩合单宁的分析[12～16]. 在2010年Monagas等[5]对花生种皮原花色素的研究中, 首次提到这两种模式在分析缩合单宁的优缺点. 这显示出探讨将两种模式结合的MALDI-TOF质谱分析方法在植物缩合单宁的研究中具有潜在的应用价值.

荔枝果实含有丰富的缩合单宁. Roux等[17]最早研究报道了荔枝(Litchi chinensis cv. Kwai Mi)果皮含有高达22聚体的A型原花色素. 但是, 由于Roux等[17]是利用ESI质谱进行分析, 原花色素, 特别是高聚原花色素在ESI过程中发生多重离子化, 且产生大量的碎片峰, 这使得获得的ESI质谱图极为复杂, 难以正确获得准确的结构信息. 因此, 本研究以荔枝(Litchi chinensis cv. Lanzhu)果核缩合单宁为研究对象, 分析其在反射模式和线性模式下的MALDI-TOF图谱特征, 探讨联合此两种模式对植物缩合单宁进行“全面”准确分析的MALDI- TOF质谱方法.

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及样品

Bruker Reflex III基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(德国, Bruker公司); SHZ-IIIB循环水真空泵(上海, 上海仪表供销公司); SENCO旋转蒸发仪(上海, 上海申科科技有限公司); DS-1高速组织捣碎机(上海, 上海标本模型厂); FD-1冷冻干燥机(北京, 北京德天佑科技发展有限公司). Amberlite IRP-64离子交换树脂、氯化钠(纯度99.999%)和2,5-二羟基苯甲酸(美国, Sigma公司); 样品纯化所用色谱填料是Sephadex LH-20(美国, Amersham公司); 实验所用丙酮、甲醇、正己烷和乙酸乙酯均为分析纯(上海, 国药集团化学试剂有限公司); 实验用水均为二次去离子水. 兰竹荔枝(Litchi chinensis cv. Lanzhu)果核.

1.2 样品处理

兰竹荔枝, 2010年7月份购买于厦门大学附近水果市场, 果实去掉果壳与果肉后, 果核用蒸馏水清洗后置于组织捣碎机中用70%丙酮溶液捣碎搅拌提取, 并过滤. 提取液在40 ℃水浴下旋转减压蒸发除去丙酮. 含有缩合单宁的水相先后用正己烷、乙酸乙酯萃取去除脂类物质及小分子酚类后, 将水相冻干获得荔枝果核缩合单宁粗提物. 粗提物用少量50%甲醇溶液溶解后上Sephadex LH-20凝胶柱纯化得到荔枝果核缩合单宁纯化物[13]. 纯化得到的样品冻干后进行不同模式的MALDI-TOF质谱分析.

1.3 样品分析

荔枝果核缩合单宁纯化样品前处理参考文献[11], 并略有改变: 2,5-二羟基苯甲酸为基质(30%丙酮溶液, 10 mg/mL); 兰竹荔枝果核缩合单宁纯化物待测样(30%丙酮溶液, 10 mg/mL); 基质和样品均用Amberlite IRP-64离子交换树脂进行去离子处理3次. 去离子后的样品溶液与氯化钠(水溶液, 2.0 mg/mL)以1∶1 (V/V, 体积比)充分混合, 混合液随后立即与去离子后的基质溶液以1∶3 (V/V, 体积比)的比例充分混合, 并取1.5 µL在靶上点样. 室温条件下挥发干溶剂进行MALDI-TOF质谱分析.

MALDI-TOF质谱仪器参数如下: (1)在反射模式下, 氮激光波长337 nm, 激光脉冲宽度3 ns, 加速电压20.0 kV, 反射电压23.0 kV, 延时取出电压16.32 kV, 聚焦电压9.45 kV; (2) 在线性模式下, 氮激光波长337 nm, 激光脉冲宽度 3 ns, 加速电压20.0 kV, 延时取出电压16.25 kV, 聚焦电压10.0 kV. 外标均为Angiotensin II (1046.5 Da), Bombesin (1619.8 Da), ACTHclip18～39 (2465.2 Da)和Somatostatin 28 (3147.47 Da).

2 结果与讨论

荔枝果核缩合单宁在去离子处理后, 引入Na＋作为阳离子化试剂, 采用不同模式MALDI-TOF MS进行分析, 得到清晰的反射模式图谱(图1)和线性模式图谱(图2). 对比分析两者及各自放大的四聚体图谱(图3), 可以得到如下结论.

2.1 反射模式的MALDI-TOF质谱分析

解析反射模式图谱(图1), 并参考文献[18, 19], 建立方程式: [M＋Na]＋＝2＋288a＋304b＋272c－2d＋23,