焦磷酸测序技术原理及应用

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术

焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。

一.焦磷酸测序技术原理

焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine-

5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。

1.每次加入一个dNTP,在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）；

2.硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比).

3.多余的dNTP被降解，开始新一个循环.

4.

测序结果

2.技术平台：

QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48Autoprep，PyroMark Q96ID焦磷酸测序仪

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3.焦磷酸测序实验流程

4.焦磷酸测序技术应用1)DNA甲基化检测

2)全基因组甲基化水平检测：LUMA法

4.SNP定量检测/等位基因差异表达检测