基因打靶技术在实验动物中的研究进展

第19卷　第2期2002年6月实验动物科学与管理

LABORAT ORY ANI M A L SCIE NCE AND ADMI NISTRATI ON V ol.19　N o.2June 2002

综述・进展

基因打靶技术在实验动物中的研究进展

高正琴　邢　华　李厚达

(扬州大学比较医学中心,扬州　225009)

摘要:简要阐述了基因打靶的概念和基本环节,系统介绍了筛选方法和基因打靶的策略。基因打靶在基因功能研究、人类疾病动物模型的建立和基因治疗等方面有着广阔的应用前景。关键词:同源重组;基因打靶;胚胎干细胞;动物模型

中图分类号:Q95ΠK C8　文献标识码:A 文章编号:1006-6179(2002)022*******

收稿日期:2002202210

作者简介:高正琴(1976-),女,江苏杨州人,扬州大学硕士研究生,主要从事微生物学和免疫学研究。电话:(0514)7979384,E 2mail :zq 2

gao1220@ 。

基因打靶是一项十分有效的技术,胚胎干细胞(Embry onic stem cell ,ES 细胞)基因打靶途径建立的小鼠模型,首次使体外精细的基因操作与小鼠的整个生长发育和生命过程得到了直接的结合,开始了对高等动物基因组的结构和功能进行系统解剖的时代。

同源重组(H om olog ous recombination )又称一般性重组或非特异性重组(G eneral recombination ),是指相似的DNA 交换遗传信息的过程。早在二十世纪初,M organ 等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA 重组是产生交换的基础。Smith 2

ies 等[1]

最早于1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶(G ene targeting )通常是指用含已知序列的DNA 片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组,整合至受体细胞基因

组中并得以表达的一种外源DNA 导入技术[2]

。

自从1981年美国的Martin [3]

和英国的Evans 等[4]

分别成功地分离培养小鼠的胚胎干细胞之后,ES 细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初,小鼠ES 细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年,Bradly 等[5]

成功地用显微注射法将ES 细胞移入囊胚腔,并移植回假孕母鼠,获得生殖系嵌合体,经过适当的交配,获得了源于ES 细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES 细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年,人们利用ES 细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶

(hprt )基因敲除(G ene knock 2out )的动物模型[6]。此

后,这项技术得到了普遍应用和长足发展。目前,在ES 细胞中进行同源重组已成为一种对小鼠染色体

组任意位点进行遗传修饰的常规技术。

现在,人们不仅可通过简单的基因敲除改变活体的遗传信息,还能精确地在染色体组中进行点突变,大至几分摩染色体组片段的缺失以及染色体易位,甚至能对基因打靶进行时空上的调控[7]

。ES 细胞基因打靶途径建立转基因小鼠技术的成熟,首次使体外精细的基因操作与动物的整个生长发育和生命过程得到了直接的结合,为探讨高等生物基因组结构和功能提供了有效的方法,为人类疾病动物模型的建立和基因治疗等奠定了坚实的基础[8]。基因打靶技术使现代生命科学研究的诸多领域得到了突破性的进展。

1　基因打靶的基本环节

基因打靶的技术要点如下:(1)基因打靶载体的构建:把目的基因和调控序列等与内源靶序列同源的序列都重组到带标记基因的载体上;(2)打靶载体的导入:用电穿孔和显微注射等方法将打靶载体导入受体细胞内;(3)同源重组子的筛选:用选择性培养基筛选打靶击中的重组阳性细胞;(4)将重组阳性细胞转入动物胚胎,产生转基因动物,并进行形态观察和分子生物学检测。

2　基因打靶的靶细胞

基因打靶最常用的靶细胞是小鼠ES细胞。ES 细胞一般是指从附植前胚胎内细胞团(IC M)或原始生殖细胞(PG Cs)经体外分化抑制培养分离出来的具有全能性(T otipotenty)和多能性(Pluripotency)的细胞。全能性是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织发育潜力,即能发育成完整动物个体的能力。多能性是指ES细胞具有发育成多种组织的能力,参与部分细胞的形成。

加入滋养层细胞(Feeder Cell)或白血病抑制因子(LIF)可在体外分化抑制培养ES细胞使其保持全能性或多能性并可在体外扩增、遗传操作、选择、克隆和冻存等。体外定向改造ES细胞,可使基因的整合数目、位点、表达程度、插入基因的稳定性和筛选工作等均在细胞水平上进行。

用于基因打靶的ES细胞系遗传背景一般为129Πsv、C57BLΠ6和BA LBΠc近交系小鼠。虽然已建立了大鼠、鸡、猪、灵长类和人的ES细胞[9],但却只有小鼠ES细胞进入囊胚能重新分化形成生殖细胞,这限制了对大型哺乳动物ES细胞基因打靶突变。近年来,随着核移植和体细胞克隆技术的发展,人们已能对体细胞进行基因打靶[10]。1997年,Mateyak 利用体细胞基因打靶成功地获得了基因缺失导致的细胞表型。

3　基因打靶载体的构建

基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列,其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体的同源重组序列一般先通过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到含有目标基因(靶基因)的克隆后,选取适当DNA片段而得到;也可利用PCR对基因组目标位点的DNA序列进行扩增得到[11]。

基因打靶载体有基因插入型载体(G ene2insertion vector)和基因置换型载体(G ene2replacement vector)。插入型载体中与靶基因同源的区段内含有特异的酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧,线性化后,同源重组使染色体DNA序列被打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。Capecchi报道,用显微注射法导入可得到很高的转染效率,占接受外源DNA细胞的10%—20%,但显微注射每次只能注射一个细胞,而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Man2 s our等研究发现电穿孔可使1%的ES细胞稳定转染。1993年,Squires等用精子载体法制作转基因鸡,其阳性率为15%—25%。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力,可用于时空特异性基因打靶,在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力[12]。

为获得基因敲除小鼠,首先应在体外构建一个基因打靶载体,这个载体上含有一段与欲灭活的基因具有高度同源性的外源基因,在外源基因中插入一带有启动子的选择标记基因。将该载体经显微注射或电穿孔等方法导入ES细胞中,使导入细胞中外源基因与染色体上的靶基因发生同源重组。通过筛选标记基因检出发生同源重组的ES细胞并在体外扩增,再将带有ES细胞的囊胚移植到假孕母鼠子宫内,发育成一个嵌合体,如果外源基因与生殖细胞整合,经过进一步杂交获得含有外源基因的纯合子,即G ene knock2out小鼠。

4　基因打靶的筛选方法

由于真核细胞内发生同源重组的机率非常低,因此要把发生定点整合的细胞从大量随机整合(Random insertion)的细胞中筛选出来,就成了基因打靶要解决的关键技术问题[13]。

基因打靶最常用的筛选方法是正负双向选择法(P ositive2negative,PNS)。正选择标记基因neo基因常被插入打靶载体同源区一个内显子中部,它既可使靶基因失活,又可作为选择标记;负选择标记基因HS V2tk基因被插在同源序列与非同源序列之间。使用含有G418的选择性培养基进行生长筛选时,发生同源重组的ES细胞因对G418有耐受性而存活,其中发生同源重组细胞的非同源片段HS V2tk将被切除,但发生随机整合的细胞却由于基因的表达产物HS V2tk酶可将培养基中的G anciclovir转化成毒物而致死。Capecchi等(1988)运用PNS法成功地对

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