第二章基因工程制药新版(2)

（4）转导作用分类
（1）限制性转导作用----由温和的噬菌体或者病 毒DNA为载体所构成的重组DNA，经过体外包装， 形成完整的噬菌体或者病毒颗粒，所进行的转导 作用称为限制性转导。 （2）广义性转导作用----任意DNA片段，或者重组 的DNA，经过体外包装成噬菌体颗粒，所进行的转 导作用称为广义性转导。
细胞吸收外源DNA的启发而
发展起来的。当核酸以磷酸 钙—DNA共沉淀物的形式在
时，细胞摄取DNA的能力显
著加强。但转移效率较低， 仅有1%~5%的外源DNA可 进入受体细胞核中，约有 1%DNA可在细胞中稳定表 达。
8、病毒介导的生物 学方法
带有外源基因的逆转录 病毒或DNA病毒在包装细 胞内可形成完整的病毒 颗粒，并被释放到培养 基中，感染哺乳动物细 胞，能有效实现基因转 移。
（2）转导条件
体外重组的DNA，要通过转导途径进入宿主 细胞，必须经过蛋白质包装的环节， DNA+噬菌体头部蛋白 + 噬菌体尾部蛋白→ 形成完整的噬菌体颗粒，才具有感染能力。
（3）转导程序
[A]、蛋白质体外包装程序 [B]、转导程序
[A]、蛋白质体外包装程序
蛋白质的体外包装是通过互补作用实现的。 λ噬菌体的D基因、E基因是表达蛋白质的主要基因。 （1）D基因所表达的蛋白质占20%、D基因突变，在 宿主体内产生大量头部蛋白。 （2）E基因所表达的蛋白质占78%、E基因突变，在 宿主体内产生大量头尾蛋白。
感受态(competent) :指细胞在一定的生理状 态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色 体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的 改变。
（4）人工感受态细胞
在基因工程中，宿主细胞经过人工处理，最后 成为感受态细胞，称为人工感受态细胞。所有 生物细胞均可处理成人工感受态细胞。 制备人工感受态细胞的方法： （1）将对数生长期细胞于低温、低渗的CaCl2 溶液中处理，就可成为感受态细胞。 （2）用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳 离子DETE-Sephadex处理，改变细胞膜结构， 也能成为感受态细胞。
大肠杆菌E . coli培养至对数生长期
↓ ↓ ↓
取20ml，悬浮于0.1M CaCl2
离心，收集沉淀的原生质球。
再悬浮于0.1M CaCl2 加入2-3ug重组的DNA，混匀 0℃放置30min
↓ ↓
↓
42℃，90s
↓
↓ ↓ ↓
冰浴5min 离心，收集沉淀的细胞
[5] 转 化 程 序
将细胞涂于选择性培养基上，进行培养
5、基因枪注射技术
是一种全新的基因导入技术，它把DNA包被在 金或钨的微粒中，然后由基因枪将此包被颗 粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目 前国际上最先进的基因导入技术。
基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、 细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、 安全、高效的特点。
基因枪注射技术
6、电穿孔技术
（5）丝状真菌

曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了 成熟的发酵和后处理工艺。 优点： （1）有很强的蛋白质分泌能力， （2）能正确地进行翻译后的加工，如进行糖基化、 肽剪切。
（6）动物细胞
优点： （1）表达产物可以分泌到培养液中， （2）培养液成份完全由人所控制， （3）所分泌的基因产物接近于天然产物， （4）产物容易得到提纯。
3、脂质体介导的融合作用
（1）定义
（2）脂质体的特性 （3）脂质体介导融合的步骤 （4）脂质体介导的应用
（1）定义
将重组的DNA分子包埋于 脂质体微囊之中，通过 脂质体微囊与宿主细胞 的融合作用，而将外源 性目的基因转移到宿主 细胞内的过程称为脂质 体介导的融合作用。
（2）脂质体的特性
脂质体：人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状 结构。 原理：受体细胞的细胞膜表面带负电荷，脂质体 颗粒带正电荷，利用引力作用，把DNA、 mRNA及单链RNA等导入细胞内 主要适用于真核细胞,可对基因进行瞬时表达和 稳定表达。
2、宿主细胞的类型
原核细胞类：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。 真核细胞类：酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细 胞和植物细胞。
（1）大肠杆菌 （2）枯草芽孢杆菌 （3）链霉菌 （4）酵母菌 （5）丝状真菌 （6）动物细胞
（1）大肠杆菌
优点：
（1）生长迅速、大规模发酵经济。Baidu Nhomakorabea
（2）分子遗传结构清楚、操作简单。 （3）基因工程研究中采用最多的表达体系。
五、宿主细胞的选择和基因导入操作
体外重组的DNA分子，如果不引入到宿主细胞，则无法显 示其生命力，而只是表现出纯粹的试剂性质。随着时间的 推移而逐渐失活。
（一）宿主细胞的选择
（二）具体的转移技术 （三）大肠杆菌中的基因导入和表达 （四）酵母菌中的基因导入和表达 （五）动物细胞中的基因导入和表达
（一）宿主细胞的选择
多肽蛋白质 菌体内 融合蛋白质 多肽蛋白质 糖基化蛋白 完 整 糖基化蛋白 菌体内 外分泌 外分泌
一般
酵
母
菌体内 稍复杂 简单
不大
哺乳动物
需注意 致癌
（二）具体的转移技术
1、转化作用 2、转导作用
1、转化作用
（1）基本概念 （2）转化作用的特性 （3）感受态细胞 （4）人工感受态细胞 （5）转化程序 （6）影响转化的因素
利用脉冲电场提高细胞膜的 通透性，从而使外源DNA转 移至细胞中。此法简单、效 率较高，几乎所有细胞都可 用此技术，此方法转染的 DNA不仅是线性的，还可是 环状的。 条件：电压：300～600V 维持时间：20～100ms 温度：0℃
7、磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术
此法受二价金属离子能促进
（1）基本概念
转化 (transformation)： 以质粒为载体构建的重组 DNA分子导入原核细胞 的过程.
（2）转化作用的特性
（1）是自然界经常发生的现象之一。
（2）转化作用的前提条件是宿主细胞必须转 变为感受态细胞。
（3）转化作用的先决条件是要获得携带目的 基因的重组DNA分子。
（3）感受态细胞
（3）脂质体介导融合的步骤
分为2步：
（A）人工脂质体的制备
（B）脂质体与宿主细胞的融合
（A）人工脂质体的制备
在含有重组DNA分子的水溶液中 + 磷脂 + 吐温80（乳化剂） ↓ 通过激烈搅拌或者超声波处理，将磷脂分散到水溶液之中 ↓ 再经过静置，磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜 ↓ 将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。
（B）脂质体与宿 主细胞的融合
将脂质体微囊与宿主细 胞混合，在PEG、或者 在其它促融剂的作用下， 经过一定条件就会产生 融合作用，最终将重组 DNA导入到宿主细胞之 中。
（4）脂质体介导的应用
对于一些微生物如放线菌细胞，由于无法形成
感受态，也就不能通过转化作用导入外源性DNA。
但是，通过脂质体介导方法，就能实现脂质体与 放线菌细胞之间的融合，来获得基因工程放线菌。
根据菌落特性，筛选出基因工程菌
（6）影响转化的因素
重组DNA转化率很低，在0.1%左右。影响因素： （1）宿主的限制酶对外源性重组DNA的限制作 用，会大大降低转化率， （2）宿主细胞的人工感受态形成率，会影响转化 率， （3）重组DNA的构型与转化率有一定的关系， 环状DNA的转化率要比线性DNA高出10-100倍， （4）外源基因与宿主DNA和同源性越高，其转 化率也越高。 （5）重组DNA的浓度越高、其转化率也越高， DNA的纯度越高、其转化率也越高。
转化过程总结示意图
2、转导作用
（1）基本概念 （2）转导条件 （3）转导程序 （4）转导作用分类
（1）基本概念
自然界中，通过噬菌体或者病毒 的感染作用，将一个细胞的遗传 信息传递到另一个细胞的过程， 称为转导（transduction）。 感受态细胞吸收以噬菌体、病毒 为载体的重组DNA的过程称为转 染(transfection)。也属于转导 作用。 自然界许多温和噬菌体都具有转 导功能。
缺点： （1）生产慢、 （2）生产率低、 （3）培养条件苛刻、费用高， （4）培养液浓度较稀。
至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达 的基因重组生物技术药物53种，其中激素类 5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种， 治疗性抗体17种。
主要基因工程表达体系比较
表达体系 大肠杆菌 产 物 产生部位 培养方式 容易 部分高产 容易 可高产 较难成本高 可高产 提 纯 产物活性 对原核好 对真核差 真核的接近 天然产物 可达天然 产物 潜在危性 不大

脂质体2000: Invitrogen , 规格 0.75ml/1.5ml 报价1700元/2900元
在特定的显微镜下，用特制的 玻璃微管，将重组的DNA直接注 射到宿主细胞内的方法。 显微镜注射技术是一种直接、 简单、而又准确、可靠的DNA机 械转移技术。 主要用于真核生物
4、显微镜注射技术
1、宿主细胞应满足的条件
2、宿主细胞的类型
1、宿主细胞应满足的条件
（1）容易获得较高浓度的细胞。 （2）能够利用廉价原料进行生产。 （3）不致病。 （4）不产生内毒素。 （5）发热量低。 （6）需氧低。 （7）具有一定的细胞形态。 （8）需有适当的发酵浓度。 （9）容易进行代谢调控。 （10）容易进行DNA重组技术操作。 （11）产物的产量稳定、产率高。 （12）产物容易提取和纯化。
[B]、转导程序
用于制备包装蛋白质的宿主细胞------cI857大 肠杆菌E . coli、BHB2690、BHB2688。
↓ D基因突变型宿主BHB2690培养、并且进行溶菌处理，提 取DNA-d ++ 外源性目的基因DNA + + E基因突变型宿主BHB2688培养、并且进行溶菌处理， 提取DNA-e ↓ 温育,包装成完整的外源基因-λ噬菌体重组颗粒。（具 有再感染能力） ↓ 去感染大肠杆菌E . coli ↓ 完成转导
缺点： （1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。 （2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来，形成杂质。给提取带来困难。 （3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在 提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。 （4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白 产物进行糖基化及磷酸化等修饰。 （5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。 （6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。
第三节 基因工程制药生产的基本过程
一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重 组生物技术药物8种：
胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫
苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。
虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修
饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差 甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋 白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵 母表达系统表达。
至2004年，FDA共批准了大肠杆菌表达的基 因重组生物技术药物18种：
重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、
白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。
（2）枯草芽孢杆菌
优点： （1）分泌能力很强，可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 （2）不会形成包含体。 缺点： （1）不能使蛋白质产物糖基化。 （2）枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统，常常对蛋白质产物造成破坏。
（3）链霉菌
优点： （1）不致病， （2）使用安全， （3）分泌能力强， （4）可将培养产物直接分泌到培养液中， （5）具有糖基化能力 近年来，作为外源基因表达体系，正日益受到人 们的重视。
（4）酵母菌
酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在 酵母菌中进行克隆和表达。
优点： （1）是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物， （2）其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行 大规模培养， （3）无毒性， （4）基因工程操作简单， （5）表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外， （6）能够对蛋白质产物进行糖基化， （7）真核基因在酵母中表达良好。