心肌细胞生长、死亡与再生

成体干细胞与心肌梗死
骨骼肌成肌细胞： 将经处理的骨骼肌成肌细胞注入到一位等待接受 心脏移植的志愿病人心脏内,结果发现心脏能在 较长时间内工作良好而无须接受心脏移植。 将大约7X106 个骨骼肌成肌细胞自体植入兔的心 肌组织的瘢痕边缘中，发现成肌细胞可以修复心 肌的瘢痕组织
成体干细胞与心肌梗死

1999，FELIX：成年心肌细胞＋出于S期 新生鼠（2D）核与细胞质提取物—70％ 进入细胞周期 2002 QUAINI 正常心肌细胞中存在原始 细胞，可分裂增殖

压力负荷


血流动力学改变是细胞生长的重要因素 当心功能处于代偿期、无心衰－以肥大 为主 当心功能下降、心衰—出现增殖
正常细胞寿命
新生心肌细胞检测方法

心肌细胞鉴别 DNA合成检测 有丝分裂图 3H－TDR BRDU PCNA Ki-67
心肌细胞鉴别
搏动 相关蛋白检测丝分裂图：光镜＋组化（假阴性） 3H－TDR：高特异性（放射性污染） BRDU：DNA合成底物（假阳性） PCNA：灵敏（假阳性，DNA修复期， 凋亡细胞，肿瘤细胞） Ki-67：仅与核分裂有关，灵敏，特异 性高
-26 mV
B
-38 mV
5 mV
25 s
BMSCs获得的心肌分化表型的膜电位改变
实验材料与仪器设备
骨髓单个核细胞
骨髓单个核细胞是指骨髓中细胞核形态 为单个核细胞的总称,包括造血干细胞、 成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞 前体细胞等。 注入猪的心肌梗死灶中,可显著提高射血 分数, 增加局部血流, 增加梗死灶侧枝循 环 将骨髓造血干细胞植入急性心肌梗死患 者病灶内,可缩小梗死面积, 增加射血分数、 心脏指数,以及降低运动时舒张末容积等。
成体干细胞与缺血的心肌组织

造血干细胞：移植到裸鼠的体内,10周后制成心 肌缺血再灌注损伤的模型,发现造血干细胞迁移 到心肌受损伤的病灶内,并形成新生血管及心肌 细胞。
成体干细胞与缺血的心肌组织

单个核细胞（成人外周血）体外培养7 天获得的造血干细胞静脉注射给心 肌梗死大鼠 7天后：在缺血的心肌组织 中聚集着标记的造血干细胞已转化为血 管母细胞，并整合到局部新生的血管中 /28天后超声检查：心功能得到改善，梗 死区周围以及缺血区域的血管密度增加， 右心室瘢痕较对照组减小。

骨髓来源的干细胞(BMC)
多潜能、未分化，在一定条件下可重 建组织器官（组织工程）；损伤是分 化的动力，如缺血坏死等 输入BMC：分化为心肌、血管内皮、 血管平滑肌 干细胞动员剂：改变心梗功能，细胞 增殖，新生细胞15/ 106，动脉毛细血管 生成。 BMC体外定向诱导：有搏动的心肌
优点
自体移植无 免疫排斥反应
多向分化潜能
可促进血管新生
已成为细胞移植的首选供体！
骨髓间充质干细胞（BMSCs）

大量研究表明：
BMSCs在一定条件下可诱导分化为心肌 细胞（CM）及血管内皮细胞，目前关于 其分化的机制尚未明确，有学者提出，环 境诱导分化是其中的重要因素。
环境诱导分化

环境诱导分化是干细胞进入微 环境后受周围细胞的影响，对 相应的各种物理或化学信号做 出反应。

调控心肌细胞分裂的细胞因子



胰岛素样生长因子 心脏营养因子 白介素－1 成纤维生长因子 1，25－（OH）2-D3 其他：细胞周期素，细胞周期蛋白依赖 激酶（CDK），CDK抑制因子，P21， P27，TGF-ß
成体干细胞在心脏疾病中的应用
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。由 于胚胎干细胞移植存在着免疫排斥，从而限 制了其在临床上的应用。近年来发现多种组 织来源的成体干细胞存在着多向分化潜能， 在特定条件下可定向诱导分化为多种组织的 功能细胞。成体干细胞作为成年新生心肌细 胞的重要来源之一，在心脏疾病中的治疗中 受到极大关注，其最大优点是避免排斥反应， 因而有望优先进入临床使用。
抗α-actinin 、抗MEF-2C 染色阳性的BMSCs
GFP TORPO-3 重叠
α-actinin
MEF-2C
共聚焦显微镜下观察染色结果 (10X40)
荧光显微镜下搏动的GFP-BMSCs
电生理记录(膜片钳技术检测结果)
0 mV 20 mV
A
-51 mV 5s
20 mV
250 ms
正常CM膜电位改变
成体干细胞与缺血的心肌组织

骨髓间充质干细胞：3周后缺血心肌组织 的血供明显改善。血管造影表明，侧支 循环的数目增加5-7倍，新生的毛细血管 与宿主的血管网相通，且有舒缩反应/注 入到结扎左冠状动脉2周后的小鼠升主动 脉内病灶内, 形成新生的心肌细胞或成 纤维细胞
成体干细胞与心肌梗死
骨髓造血干细胞：直接注入到裸鼠心脏的心肌梗 死病灶周围, 心功能指标有明显改善;九天后病检 发现,在心肌梗死病灶周围由新生血管样结构及心 肌细胞组成的新生组织,而对照组未见此结果。
问题

心肌细胞的寿命＝人的寿命？ 正常心肌细胞不存在死亡？ 肥大心肌：细胞肥大》细胞坏死？
对心肌细胞死亡的观察


现代标记手段 ： 正常心肌细胞存在死亡，如果没有再生， 几十年内心脏将丢失大部分 心衰者心肌细胞死亡 ，如果没有再生， 心脏在几个月或几年内会消失 死亡 再生 死亡方式：凋亡，坏死，两者均有 正常、缺血：以凋亡为主； 梗死区：以坏死为主，周边以凋亡为主

骨髓来源的干细胞(BMC)

骨髓间质干细胞 骨髓单个核细胞 骨髓造血干细胞 骨髓成血管细胞
骨髓间质干细胞
具有多分化潜能,可分化为骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞与肌肉细胞等。 人和动物的骨髓间质干细胞在体外经定 向诱导后可分化为心肌细胞、骨细胞、 软骨细胞等。 将纯化的骨髓间质干细胞注入到结扎左 冠状动脉的小鼠升主动脉内,发现骨髓间 质干细胞可经冠脉循环到达心脏的缺血 损伤病灶内,形成新生的心肌细胞或成纤 维细胞。
心肌干细胞

Oh H 6－12周龄的 C57BL/6小鼠心脏，Sca-1+, lin–, CD45–, CD31+ CD38+细胞： 缺乏血细胞系、骨髓造血干细胞、内皮祖细胞、成 熟内皮细胞表型 可表达一系列心肌转录基因（GATA-4， MEF-2C， TEF-1），但不表达心肌结构基因（- MHC ，MHC，MLC-2a，MLC -2v，c&sk -actin等） 在体外分化成心肌细胞，将其注入心肌梗死区后也 能在体内分化成心肌细胞，改善心脏功能。
骨髓成血管细胞
存在于骨髓中的一种成血管细胞,表达Ｃ Ｄ34+,是血管内皮细胞的前体细胞. 将其从静脉注射到裸鼠心梗动物模型体 内,2天后,可迁移至梗死灶内,诱导病灶内 的微血管发生增殖与再生,抑制病灶周围 的心肌细胞凋亡,抑制心肌重构,减少瘢痕 的形成,并显著改善心功能。

肝脏来源的干细胞

来源于肝脏的干细胞亦可在体内被诱导 成心肌细胞。将来源于鼠肝的干细胞直 接注射到裸鼠的左心室壁内,可在左心室 壁内形成新生的心肌细胞,而且,与内源的 心肌细胞结合完整,形成缝隙连接和闰盘。

心肌细胞体积：大细胞－老 小细胞－年轻 4M 大鼠 4000－11000um3 >9000um3，P161nk4a （抑制细胞进入细 胞周期）表达增多，凋亡增多。 小细胞P161nk4a 表达少，DNA复制活跃。
在正常、病理情况下，死亡

再生
增殖细胞来源：

KAJSTWRA实验室：把女性心脏移植到男性体 内，心肌细胞内出现Y染色体。 骨髓来源的干细胞 肝脏来源的干细胞 血管来源的干细胞 骨骼肌来源的干细胞 心肌干细胞
植入心肌组织的成肌细胞在超微结构上 与正常心肌细胞不同，它们缺乏A及M带， 提示骨骼肌成肌细胞可能仅仅是增加了 瘢痕组织的顺应性，而不是收缩功能。 因此，无收缩功能的成肌细胞的心肌植 人能否与正常的心肌细胞有相似的生理 功能还值得进一步探讨。

成体干细胞与心功能不全

有人将同源骨骼肌成肌细胞植入大鼠心力衰竭模 型的心肌组织中，研究结果表明，能够有效地防止 心室的扩张，左心室压力上升和下降最大速率增加， 改善心脏的功能。自体骨髓间充质干细胞的移植有 助于心力衰竭患者心功能的改善，为心力衰竭的治 疗开辟了一个新的途径。
血管来源的干细胞

从胚胎鼠的主动脉内提取血管内皮细胞, 将其与鼠心肌细胞在体外共同培养,发现 血管内皮细胞分化为心肌细胞;将其注射 到鼠的心脏内,也被诱导分化为心肌细胞; 将人的脐静脉血管内皮细胞,在上述类似 的环境中培养,也可分化为心肌细胞。
骨骼肌来源的干细胞

骨骼肌中的成肌细胞,又称卫星细胞, 也具 有干细胞的功能,可分化形成新的骨骼肌 细胞。将成肌细胞移植到受损的心脏内, 可分化为肌样细胞,但形态上与心肌细胞 有差异。有研究报道,将骨骼肌成肌细胞 移植到人的心脏内,可改善心脏功能。
前景
综上所述，针对成年心肌细胞生长、死亡与 再生的最新研究打破了长期以来将心肌细胞 作为终末分化细胞的观念，从而为相关的基 础及临床研究开辟了新的方向，并随着成体 干细胞应用的研究进一步深入，为临床心血 管疾病的治疗提供了新的前景。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）
取材方便 不存在伦理问题
高度自我 更新能力
心肌细胞生长、死亡与再生
一般概念

终末分化：rat 3－4d 肥大：
human 5m
退出细胞周期后，以肥大代替增殖； 心脏负荷增加，以肥大代偿； 心肌细胞死亡，以瘢痕修复，以肥大代偿。


病理刺激 心肌受损 心肌肥大 心力 衰竭 治疗：去除病因，减少负荷，逆转肥大
心肌细胞是否有再生能力
•19世纪末－20世纪初：具有增殖能力 •1921－1925年：不具备增殖能力 1.终末分化 2. 缺乏干细胞 3.心肌坏死，以瘢痕修复 4.少量增殖：是偶然，非主流

对心肌细胞增殖的观察

2001 BELTRAMI:13例心肌梗塞
细胞分裂相关核抗原Ki-67检测－
近梗塞区4％心肌细胞检出，为对照84倍
远离梗塞区1％心肌细胞检出，为对照24倍
有丝分裂指数－
近梗塞区0.08％心肌细胞检出，为对照70倍
远离梗塞区0.03％心肌细胞检出，为对照24倍
对心肌细胞增殖的观察
骨髓造血干细胞
ＳＰ细胞(side population cell) 是骨髓造血干细胞 中存在一种亚单位,表达ＣＤ34-,具有多分化潜能。 移植的ＳＰ细胞可经体循环系统迁移到心肌受损 伤的病灶内,形成新生血管及心肌细胞。 从表达绿荧光增强蛋白(ＥＧＦＰ9)基因的裸鼠 体内提取一种特异表达Lin-c kit pos基因的骨髓造 血干细胞,将其直接注入到裸鼠心脏的心肌梗死 病灶周围,可明显改善心功能指标，并在梗死病 灶周围形成相当于病灶68%大小的新生组织,其 中包含新生血管样结构及心肌细胞。

其机制可能与细胞接触、基 因水平调控、细胞因子调控 等有关。
共培养前GFP-BMSCs与CM的形态学特征
光镜下(10X20) 荧光显微镜下(10X20)
GFP-BMSCs
CM
共培养后抗Troponin I染色阳性的BMSCs
GFP
(绿)
Troponin I
(红)
Torpo-3 (蓝)
重叠
共聚焦显微镜下观察染色结果 (10X40)

骨骼肌的成肌细胞：植入心肌梗死组织中，2 周后该细胞表达慢收缩细胞的标志物肌凝蛋 白重链，而不是心肌细胞特异的标志物肌凝 蛋白。它在心肌瘢痕组织内转变为抗疲劳的 慢反应纤维，以适应心肌的负荷及做功，说 明移植的骨骼肌成肌细胞不是分化为心肌细 胞，而是分化成为能够负担心肌工作的慢收 缩细胞。
成体干细胞与心肌梗死
对心肌细胞增殖的观察



1960S,德国 LINZBACH 严重心功能障碍 伴随肥大和增生 几年后，RUMYANTSEV 细胞进入细胞 周期 1990S。PCNA,Ki67,Brdu等与增殖相关 的抗原、标记物的检出，证明心肌细胞 存在有丝分裂。
对心肌细胞增殖的观察
1994 Quaini: 心衰末期，有丝分裂指数 11/106；PCNA 49% KAJSTWRA:CONFOCUS分裂指数 对照组：14 / 106 缺血性心脏病:152/ 106 先天性心脏病:131 / 106