分子生物学常用实验技术及方法

第二章 常用实验技术及方法

一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)

反应总体积为50 µl ，其中含有：

模板DNA 0.5 µl

PCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl

10×MgCl 2 溶液 5 µl

dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl

引物1 (50 umol/L) 0.5 µl

引物2 (50 umol/L) 0.5 µl

Taq DNA 聚合酶 0.5 µl

无菌去离子水加至 50 µl

上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。

循环参数为： 94 ℃变性10 min

94 ℃变性1 min

56 ℃退火1 min

72 ℃延伸2 min

共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。

二、基于PCR 技术的定点突变

1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下

游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；

2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA

片

段1和DNA片段2；

3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：

片段1 1 µl

片段2 1 µl

10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl

10×MgCl2溶液 5 µl

dNTP (2.5 mmol/L) 5 µl

Taq酶 1 µl

加ddH2O至 50 µl

在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；

4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突

变的正确性。

三、Total RNA的提取(Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11)

1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-

14TM溶液，然后充分混匀；

2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心：

细胞数<5×105 ： 9500 rpm (约5 000×g) 5 min

细胞数5×105 - 1×107：3000 rpm (约450×g) 5 min

细胞数>1×107 ：1500 rpm (约112.5×g) 5 min

3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后，

12000 rpm离心2 min；

4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；

5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液；

6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液；

7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次；

8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。

四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit)

1. 按Takara Kit中所提供的标准步骤配制PCR 体系；

2. 按以下条件进行RT-PCR反应

(1) 50 ℃ 30 min

(2) 94 ℃ 2 min

(3) 94 ℃ 1 min

(4) 56 ℃ 1 min

(5) 72 ℃ 2 min

3. 重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环；

4. 反应结束后，取3-5 µl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。

五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳

50×TAE: 242 g Tris 碱

57.1 ml 冰乙酸

100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)

1. 称取0.5 g agarose，置于250 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1×TAE（含EB 0.5

ug/ml），加热使其全部溶解；

2. 封口、安放梳子；

3. 待凝胶稍凉后铺板；

4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1×TAE，淹没胶面，拔去梳子；

5. 将DNA 样品与6×的上样缓冲液混合，加于加样孔中；

6. 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观

察或拍照。

六、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段（Vitagene DNA 片段回收Kit）

1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管中；

2. 用Vitagene DNA 片段回收Kit，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片

段。

七、DNA 片段的连接反应

1. 总体系为10-20 µl，外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合；

2. 加入1-2 ul 10×Buffer，2 ul T4DNA连接酶，混匀；

3. 12-16 ℃反应过夜。

八、大肠杆菌感受态细胞的制备

1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜；

2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中，37 ℃振荡培养约3 h至对

数生长期(OD600 = 0.4-0.6)；

3. 将细菌转移至50 ml 离心管中，冰浴20 min；

4. 于4℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；

5. 用5 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴30 min；

6. 于4 ℃，4200 rpm 离心10 min，弃上清；

7. 用3 ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体（动作要轻），每管分装100 µl，立

即使用或置于-70 ℃冰箱保存。

九、大肠杆菌感受态细胞的转化

1. 感受态细胞若保存于-70 ℃冰箱，取出后先在冰上复苏5-10 min；

2. 加入适量DNA 样品，混匀，冰浴30 min；

3. 42 ℃水浴1 min，立即放入冰上冷却2 min；

4. 加入0.5 ml LB 液体培养基， 37 ℃振荡培养45 min；

5. 取适量转化的菌体，涂布于含抗生素的LB 平板上，等平板表面的液体被吸

收后，倒置放入37 ℃温箱，培养过夜。

十、大肠杆菌质粒DNA 的小规模制备

(一)、材料：

1. Solution I 葡萄糖 50 mM

Tris-HCl (pH8.0) 25 mM

EDTA (pH8.0) 10 mM