不同微环境下黑色素瘤细胞三维结构差异4.26

不同微环境下黑色素瘤细胞三维结构差异癌症是一种衰老的疾病。从临床来看，老年癌症患者的预后往往比年轻人差。这可能是由于细胞损伤累积、适应性免疫下降和慢性炎症。然而，老年微环境对肿瘤进展的影响在很大程度上尚未被探索。由于真皮成纤维细胞对黑色素瘤进展有深远的影响，研究了真皮成纤维细胞的年龄相关变化是否可以驱动黑色素瘤转移和靶向治疗的反应。

目前关于老化的微环境对黑色瘤的发展，其中是否对黑色素瘤的三维结构差异效果未知，因此我们设计此实验达到如下两个目的：

（1）不同肿瘤微环境下对黑色瘤的三维结构变化产生的影响

（2）尝试寻找老化微环境下对黑色瘤的作用机制，通过哪条通路上关键基因进而调控一系列基因表达变化起保护作用。

Part I. 老化微环境黑色瘤细胞模型构建

利用2个黑色素瘤细胞系（WM35和WM793）、年轻（<35岁）或衰老（>55岁）的成纤维细胞系构建了器官型皮肤重建。

（1）WM35+年轻（<35岁）成纤维细胞系

（2）WM35+衰老（>55岁）成纤维细胞系

（3）WM793+年轻（<35岁）成纤维细胞系

（4）WM793+衰老（>55岁）成纤维细胞系

测定指标：

a. CCK8 测增殖（不同组分）

b. 检测MDA、SOD 及ROS 含量的变化

C. 黑色瘤细胞形态变化

Part II. 不同微环境下黑色瘤动物模型构建及三维结构变化

实验材料：实验室构建小鼠黑色瘤模型（依据“Dankort, D. et al. BrafV600E cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genet. 41, 544–552 (2009).”)

实验分组：每组尽量多做生物学重复，减少个体误差。

Yumm1.7细胞来自于Braf V600E /Cdkn2a - / - /Pten - / - 小鼠黑色素瘤模型

（1）8周龄小鼠（幼龄）（注射Yumm1.7）

（2）52周龄小鼠（老年）（注射Yumm1.7）

测定指标：小鼠肿瘤生长速度、侵袭性、血管生成增加率，肺转移率。

小鼠处理结束后，称重，取不同处理组小鼠黑色瘤细胞进行Hi-C实验，-80°C 保存备用。

从染色质的角度分析不同微环境下黑色瘤细胞的结构差异：

（1）A/B Compartments差异分析

（2）TAD差异分析

（3）Loop差异分析

（4）TAD边界Motif富集分析

从三个层次结构上差异分析，得出不同微环境下黑色瘤结构差异的重要的转录因子或者通路。具体获悉某个重要的通路上差异loop上启动子与增强子之间的作用关系。

Part III. 转录组测序筛选差异基因

实验分组如下，每组 3 个生物学重复，共计 6 个样品：

（1）8周龄小鼠（幼龄）（注射Yumm1.7）

（2）52周龄小鼠（老年）（注射Yumm1.7）

转录组研究是研究基因功能和结构的基础，对生物体的发育和疾病的发生具有重要作用。作筛选差异基因，从中确认一条可能与不同微环境下黑色瘤相关的差异mRNA 进行，再进行qPCR 验证，再结合Hi-C的实验的结果，找到差异基因或者通路上染色质结构是否存在差异（三个层次上），确定差异关键差异基因（在染色质结构上也存在差异）

Part IV. 筛出的差异基因及Hi-C验证工作

（1）DNA FISH 验证：针上带有荧光标记，可与靶DNA形成杂交体，在荧光显微镜下可观察中行定位分析。

（2）综合实验II和III的实验结果筛选出差异基因进行过表达或敲除实验，进行qPCR和WB验证，初步验证该基因的功能。