乳酸菌冷冻保护剂的选择
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1．1．2 脱脂乳粉由圣元乳业有限公司生产。 1．1．3 氯化钠、 乳糖、 蔗糖、 谷氨酸钠均为生化级。 1．1．4 玻璃仪器： 试管， 移液管， 平板， 安玻瓶等。 1．1．5 净化工作台 SW–VJ–1FD。 1．1．6 小型旋涡混合器。 1．1．7 高压灭菌器 HVE–50 （日本 HIRAYAMA）。 1．1．8 显微镜 NIKON 50i。 1．1．9 超低温冰箱 DW–HL218 （中科美菱）。 1．1．10 恒 温 培 养 箱 SKG02．420 （ 黄 石 市 恒 丰 医疗器械有限公司）。
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 95．00±1．6971a 52．12±2．9698c 61．82±1．5556b 36．36±2．2627f 23．03±2．4042h 48．48±1．9799d 25．00±1．8385g 24．24±1．9799g 46．06±1．5556e
列的级差都大， 所以这三种物质协同作用不明 显， 不同物质溶液的保护效果为蔗糖溶液＞脱脂 乳溶液＞谷氨酸钠溶液， 相同的溶液不同浓度之 间 保 护 效 果 蔗 糖 ： 10％ ＞12．5％ ＞15％ ； 脱 脂 乳 ： 10％＞5％＞7．5％； 谷 氨 酸 钠 ： 5％＞7．5％＞10％。 同 时还发现有些试验结果反映， 由 3 种不同物质组
关键词：保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；冷冻保护剂
在乳酸菌浓缩发酵剂的制作过程中， 由于冷 冻时对乳酸菌的破坏较大， 所以冷冻保护剂的选 择一直是浓缩发酵剂制备中的一个关键。
Kilara ［1］ 认为当初始细菌浓度越大时， 冷冻 干燥获得较高存活率的几率就越大， 这主要是通 过降低了单个菌体细胞暴露在介质中的面积来达 到保护的效果。 在实际生产中尽量通过提高初始 细菌浓度来提高菌体的冷冻干燥时的存活率， 从 而减小菌体的死亡和损失。 这也正是以上培养和 离心过程中要求单位体积的培养基中菌体数目 （细菌浓度） 的原因。
3、 第 4 至 6 位为各地级市牛场、 小区或其他 形式的奶牛养殖组织编号， 由各地级市畜牧主管 部门统一编制， 编号可由英文字母和阿拉伯数字 组成。
4、 第 7 至 8 位为牛只出生年度编号， 由 2 位 数码组成， 统一采用出生年度的后两位数， 例 如： 2008 年出生的即写成 08。
5、 第 9 至 12 位 为 年 内 母 犊 出 生 顺 序 号 ， 用 阿拉伯数字表示， 不足 4 位以 0 补齐， 如该场该 年度出生的第 6 只母犊即写成 0006。
!!!!!!!!!!!!ห้องสมุดไป่ตู้!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 17 页）
表 3 保护剂正交试验结果（n＝2）
试验序号 A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3 A2B2C3 A2B3C1 A2B1C2 A3B3C2 A3B1C3 A3B2C1
试验中选取了对两种单菌 （保加利亚乳杆菌 和嗜热链球菌） 都有冷冻保护效果的蔗糖、 乳 糖、 脱脂乳和谷氨酸钠来进行实验。 有报道称影 响菌体存活率的主要因素是冷冻速率。 在缓慢冷 冻时， 胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质 浓度增高， 造成细胞水分外渗而大量脱水， 可能 使细胞死亡。 如果快速降温， 胞内也很快形成冰 晶， 胞内外渗透压基本平衡， 同时胞内冰晶较 小， 对细胞及原生质膜的损伤也较小， 菌株不易 死亡， 影响也较小。 如在–79℃、 –196℃冻结时 菌体细胞的存活率高达 90％以上。 刘振民， 骆承 庠研究发现 ［6］， 在冷冻过程中存在两个冰晶生成 带， 即： 0℃～–3．7℃和–30℃～–37．4℃。 快速通 过冰晶生成带可以减小菌体的冷冻损伤。 为了满 足上述条件， 可以在超低温冰箱中冷冻样品， 温 度设定为–80℃。 对照组 （不添 加保护剂） 存 活 率为 12％， 冷冻存活率低的原因是这个过程使较 敏感的蛋白质变性， 降低了细胞活性 ［5］。
关于印发《2008 年广东省奶牛良种补贴项目 项目实施方案》的通知（粤农［2008］217 号）
广东省奶牛编号规则
我省奶牛编号统一由 12 位字符、 分成四部分 组成： 2 位省代码＋4 位牛场号＋2 位出生年度号＋4 位场内牛只序号， 具体如下：
1、 首两位为广东省代码 44。 2、 第 3 位 为 地 级 市 代 码 ， 用 英 文 字 母 表 示 （其中： 广州市 A、 深圳市 B、 珠海市 C、 汕头市 D、 佛山市 E、 韶关市 F、 湛江市 G、 肇庆市 H、 江门市 J、 茂名市 K、 惠州市 L、 梅州市 M、 汕尾 市 N、 河源市 P、 阳江市 Q、 清远市 R、 东莞市 S、 中山市 T、 潮州市 U、 揭阳市 V、 云浮市 W）。
有 报 道 称 ［2］ 如 果 将 乳 酸 菌 培 养 液 直 接 进 行 冷冻干燥， 其存活率仅有 10％～30％左右。 但是干 燥过程对乳酸菌的损伤程度比较小， 冷冻是引起 乳酸菌死亡的主要环节。 菌体冷冻干燥的存活率 受多方面的影响， 包括起始的细胞菌液浓度， 保 护介质和再水合条件 ［3］ ， 其中保护介质的添加 是一个重要环节。 一种保护效果好的保护剂要求 在冷冻干燥过程中可以提供保护作用， 并且有良 好的自身稳定性和有利于再水合， 还可以方便有 效除去冻干材料中的多余溶剂。 关于保护剂的报 道也有很多， 比较常用的有蔗糖、 乳糖、 脱脂乳 和谷氨酸钠， 但大多是针对单菌种的， 对混菌的 保护剂研究较少。 另有国外文献报道 ［4］ 浓度为 1％～68％的 蔗糖溶液可 作 为 冷 冻 保 护 剂 ， 它 可 以 用于杆菌和球菌的保护剂， 原因是蔗糖可以抑制 表面自由基的产生， 对菌体细胞有较好的保护作
1．1．11 超 纯 水 机 KL– UP–III–10 （台 湾 艾 柯）。
1．2 试验条件 试验方法是将乳酸菌培养液 40ml 离心后的沉 淀物 （保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌比例 1： 1） 用 10ml 生 理 盐 水 完 全 溶 解 ， 在 旋 涡 混 合 器 上 将 此溶液混合均匀， 每个样品取 3ml 此溶液与等体 积的不同的保护剂溶液混合， 在–80℃冰箱 中冷 冻 24h， 在自 然条件下 使样品解冻 ， 分 别 测 定 冷 冻 前 和 冷 冻 后 每 ml 溶 液 中 的 菌 体 数 目 ， 最 终 得 到冷冻存活率， 从而选取保护效果好的保护剂， 包括保护剂的浓度。 1．2．1 正 交 试 验 这 部 分 要 列 出 因 素 水 平 表 ， 格式以下表为准：
用。 在–20℃～–70℃保存发酵剂时， 乳糖浓度在 1％～10％的溶液比甘 油 有 良 好 的 保 护 性 。 浓 度 为 1％～10％的脱脂乳溶 液也可 作 为 乳 酸 菌 的 冷 冻 保 护剂。 脱脂乳可以成为保护剂的原因是 ［5］： （1） 提高了细胞的稳定性以降低细胞损伤； （2） 创 造了一个多孔的环境有利于再水合； （3） 含有 大量的蛋白质给细胞提供了保护性的外衣。
保护剂 5％谷 氨 酸 钠 10％谷 氨 酸 钠 15％谷 氨 酸 钠
5％乳 糖 10％乳 糖 15％乳 糖
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 64±5．6569a 58±2．8284abc 45±2．8284d 45±4．2426d 50±1．4142cd 55±2．8284bc
表 2 中 的 数 据 可 以 看 出 ， 蔗 糖 浓 度 为 10％、 15％的 溶液， 脱脂 乳 浓 度 10％、 15％的 溶 液 ， 谷 氨 酸 钠 浓 度 为 5％ 、 10％ 的 溶 液 ， 乳 糖 浓 度 为 10％、 15％的 溶 液 菌 体 细 胞 存 活 率 比 较 高 ， 结 果 与吕加平， 骆承庠的研究结果相似。 在单因素的 条 件 下 ， 最 好 的 保 护 剂 是 浓 度 为 5％谷 氨 酸 钠 溶 液， 其保护效果可以达到 64％。 考虑到乳糖和蔗 糖同属于糖类， 其保护机理应当相似， 而蔗糖与 乳糖在浓度一样的情况下， 蔗糖溶液的保护效果
2 0 1 0 第1期
广东奶业
乳与乳品
乳酸菌冷冻保护剂的选择
杜磊 1，乔发东 2 （1． 安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000；
2． 河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450000）
摘要：乳酸菌浓缩发酵剂的制备过程中，冷冻对菌体的损伤比较明显。 通过在保加利亚乳杆菌和嗜热 链球菌混菌菌悬液中添加不同的保护剂并测定冷冻前后乳酸菌菌数，筛选出适用的保加利亚乳杆菌和嗜 热链球菌混菌的保护剂。 最终确定的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌保护剂配方为：蔗糖浓度为 10％， 脱脂乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％。 菌体经冷冻处理后，冷冻存活率可达到 95．00％，比不添加保护剂 的菌体存活率大大提高。 此配方也简单易得，完全可以满足生产需要。
輥輵讂
2 0 1 0 第1期
广东奶业
信息文摘
编者按： 广东省畜牧推广总站 《关于下发 2009 年广东奶牛良种补贴项目 牛冷冻精液供应计划的通知》 （粤牧技 ［2010］ 2 号） 已经下发到各地市农业 局畜牧兽医处， 鉴于很多奶牛牛场不知道编号规则， 现将 2008 年广东省奶牛 编号规则刊登， 以供参考。
3 结论 用此配方制备的保护剂对保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌保护效果良好， 并且方便易得， 在工业化生产乳酸菌浓缩发酵剂时也可使用。 参考文献 （略）
輥輯讂
单因素保护剂试验结果见表 2．
数 ／ 冷冻前溶液中的活菌数） ×100
表 2 保护剂单因素试验结果（n＝2）
保护剂 5％蔗 糖 10％蔗 糖 15％蔗 糖 5％脱 脂 乳 10％脱 脂 乳 15％脱 脂 乳
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 55±2．8284bc 60±4．2426ab 62±4．2426ab 36±2．8284e 51±2．8284cd 58±4．2426abc
表 1 保护剂正交设计表
序号 名称 水平 1（％） 水平 2（％） 水平 3（％）
1 蔗 糖 （A）
10．0 12．5 15．0
2 空 列 （D）
3 脱 脂 奶 （B）
10．0 5．0 7．5
4 谷 氨 酸 钠 （C）
5．0 7．5 10．0
1．2．2 测定方法
2 结果与分析
冷 冻 存 活 率 （％） ＝ （冷 冻 后 溶 液 中 的 活 菌
成的保护剂的保护效果还不如单因素的保护效果 好， 这可能是由于保护剂的配比不合理所致， 但 效果都比对照组 （不添加保护剂） 好。 效果最好 的保护剂配方是蔗糖浓度为 10％， 脱脂乳浓度为 10％， 谷氨酸钠浓度为 5％， 冷冻后菌体细胞的混 菌冷冻存活率可达到 95．00％， 用显微镜观察杆菌 球 菌 比 例 维 持 在 1： 1～1： 1．5， 比 例 与 原 样 中 杆 菌和球菌的比例略有升高， 这主要是由于保加利 亚乳杆菌是对冷冻干燥敏感的菌种， 而嗜热链球 菌对冷冻的敏感程度相对较低。 冷冻时， 培养液 中杆菌的死亡率比球菌高。
1 材料与方法 1．1 材料与试剂
輥輴讂
2 0 1 0 第1期
广东奶业
乳与乳品
1．1．1 MRS 固体培养基： 蛋白胨 1％， 牛肉膏 1％， 酵母膏 0．5％， 葡萄糖 2％， 吐温 80 1ml， 磷酸 二氢钾 0．2％， 醋酸钠 0．2％， 柠檬酸三铵 0．2％， 硫 酸镁 0．02％， 硫酸锰 0．005％， 琼脂 1．5％。
比乳糖溶液的保护效果明显更好， 且蔗糖易得 到， 而乳糖的成本也较高， 所以选择蔗糖进行正 交试验。
以上物质可能有协同的保护作用， 所以设计 了 4 因素 3 水平的正交试验 （正交设计表见表 1）。
正交设计后的冷冻存活率的试验结果见表 3。 对表 3 中的数据进行正交方差分析， 各列的 级差 分 别 为 ： 37．88、 18．99、 19．29、 13．89， 空 列 （第 2 列 ） 的 级 差 并 没 有 比 其 它 （下转第 11 页）
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 95．00±1．6971a 52．12±2．9698c 61．82±1．5556b 36．36±2．2627f 23．03±2．4042h 48．48±1．9799d 25．00±1．8385g 24．24±1．9799g 46．06±1．5556e
列的级差都大， 所以这三种物质协同作用不明 显， 不同物质溶液的保护效果为蔗糖溶液＞脱脂 乳溶液＞谷氨酸钠溶液， 相同的溶液不同浓度之 间 保 护 效 果 蔗 糖 ： 10％ ＞12．5％ ＞15％ ； 脱 脂 乳 ： 10％＞5％＞7．5％； 谷 氨 酸 钠 ： 5％＞7．5％＞10％。 同 时还发现有些试验结果反映， 由 3 种不同物质组
关键词：保加利亚乳杆菌；嗜热链球菌；冷冻保护剂
在乳酸菌浓缩发酵剂的制作过程中， 由于冷 冻时对乳酸菌的破坏较大， 所以冷冻保护剂的选 择一直是浓缩发酵剂制备中的一个关键。
Kilara ［1］ 认为当初始细菌浓度越大时， 冷冻 干燥获得较高存活率的几率就越大， 这主要是通 过降低了单个菌体细胞暴露在介质中的面积来达 到保护的效果。 在实际生产中尽量通过提高初始 细菌浓度来提高菌体的冷冻干燥时的存活率， 从 而减小菌体的死亡和损失。 这也正是以上培养和 离心过程中要求单位体积的培养基中菌体数目 （细菌浓度） 的原因。
3、 第 4 至 6 位为各地级市牛场、 小区或其他 形式的奶牛养殖组织编号， 由各地级市畜牧主管 部门统一编制， 编号可由英文字母和阿拉伯数字 组成。
4、 第 7 至 8 位为牛只出生年度编号， 由 2 位 数码组成， 统一采用出生年度的后两位数， 例 如： 2008 年出生的即写成 08。
5、 第 9 至 12 位 为 年 内 母 犊 出 生 顺 序 号 ， 用 阿拉伯数字表示， 不足 4 位以 0 补齐， 如该场该 年度出生的第 6 只母犊即写成 0006。
!!!!!!!!!!!!ห้องสมุดไป่ตู้!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第 17 页）
表 3 保护剂正交试验结果（n＝2）
试验序号 A1B1C1 A1B2C2 A1B3C3 A2B2C3 A2B3C1 A2B1C2 A3B3C2 A3B1C3 A3B2C1
试验中选取了对两种单菌 （保加利亚乳杆菌 和嗜热链球菌） 都有冷冻保护效果的蔗糖、 乳 糖、 脱脂乳和谷氨酸钠来进行实验。 有报道称影 响菌体存活率的主要因素是冷冻速率。 在缓慢冷 冻时， 胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质 浓度增高， 造成细胞水分外渗而大量脱水， 可能 使细胞死亡。 如果快速降温， 胞内也很快形成冰 晶， 胞内外渗透压基本平衡， 同时胞内冰晶较 小， 对细胞及原生质膜的损伤也较小， 菌株不易 死亡， 影响也较小。 如在–79℃、 –196℃冻结时 菌体细胞的存活率高达 90％以上。 刘振民， 骆承 庠研究发现 ［6］， 在冷冻过程中存在两个冰晶生成 带， 即： 0℃～–3．7℃和–30℃～–37．4℃。 快速通 过冰晶生成带可以减小菌体的冷冻损伤。 为了满 足上述条件， 可以在超低温冰箱中冷冻样品， 温 度设定为–80℃。 对照组 （不添 加保护剂） 存 活 率为 12％， 冷冻存活率低的原因是这个过程使较 敏感的蛋白质变性， 降低了细胞活性 ［5］。
关于印发《2008 年广东省奶牛良种补贴项目 项目实施方案》的通知（粤农［2008］217 号）
广东省奶牛编号规则
我省奶牛编号统一由 12 位字符、 分成四部分 组成： 2 位省代码＋4 位牛场号＋2 位出生年度号＋4 位场内牛只序号， 具体如下：
1、 首两位为广东省代码 44。 2、 第 3 位 为 地 级 市 代 码 ， 用 英 文 字 母 表 示 （其中： 广州市 A、 深圳市 B、 珠海市 C、 汕头市 D、 佛山市 E、 韶关市 F、 湛江市 G、 肇庆市 H、 江门市 J、 茂名市 K、 惠州市 L、 梅州市 M、 汕尾 市 N、 河源市 P、 阳江市 Q、 清远市 R、 东莞市 S、 中山市 T、 潮州市 U、 揭阳市 V、 云浮市 W）。
有 报 道 称 ［2］ 如 果 将 乳 酸 菌 培 养 液 直 接 进 行 冷冻干燥， 其存活率仅有 10％～30％左右。 但是干 燥过程对乳酸菌的损伤程度比较小， 冷冻是引起 乳酸菌死亡的主要环节。 菌体冷冻干燥的存活率 受多方面的影响， 包括起始的细胞菌液浓度， 保 护介质和再水合条件 ［3］ ， 其中保护介质的添加 是一个重要环节。 一种保护效果好的保护剂要求 在冷冻干燥过程中可以提供保护作用， 并且有良 好的自身稳定性和有利于再水合， 还可以方便有 效除去冻干材料中的多余溶剂。 关于保护剂的报 道也有很多， 比较常用的有蔗糖、 乳糖、 脱脂乳 和谷氨酸钠， 但大多是针对单菌种的， 对混菌的 保护剂研究较少。 另有国外文献报道 ［4］ 浓度为 1％～68％的 蔗糖溶液可 作 为 冷 冻 保 护 剂 ， 它 可 以 用于杆菌和球菌的保护剂， 原因是蔗糖可以抑制 表面自由基的产生， 对菌体细胞有较好的保护作
1．1．11 超 纯 水 机 KL– UP–III–10 （台 湾 艾 柯）。
1．2 试验条件 试验方法是将乳酸菌培养液 40ml 离心后的沉 淀物 （保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌比例 1： 1） 用 10ml 生 理 盐 水 完 全 溶 解 ， 在 旋 涡 混 合 器 上 将 此溶液混合均匀， 每个样品取 3ml 此溶液与等体 积的不同的保护剂溶液混合， 在–80℃冰箱 中冷 冻 24h， 在自 然条件下 使样品解冻 ， 分 别 测 定 冷 冻 前 和 冷 冻 后 每 ml 溶 液 中 的 菌 体 数 目 ， 最 终 得 到冷冻存活率， 从而选取保护效果好的保护剂， 包括保护剂的浓度。 1．2．1 正 交 试 验 这 部 分 要 列 出 因 素 水 平 表 ， 格式以下表为准：
用。 在–20℃～–70℃保存发酵剂时， 乳糖浓度在 1％～10％的溶液比甘 油 有 良 好 的 保 护 性 。 浓 度 为 1％～10％的脱脂乳溶 液也可 作 为 乳 酸 菌 的 冷 冻 保 护剂。 脱脂乳可以成为保护剂的原因是 ［5］： （1） 提高了细胞的稳定性以降低细胞损伤； （2） 创 造了一个多孔的环境有利于再水合； （3） 含有 大量的蛋白质给细胞提供了保护性的外衣。
保护剂 5％谷 氨 酸 钠 10％谷 氨 酸 钠 15％谷 氨 酸 钠
5％乳 糖 10％乳 糖 15％乳 糖
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 64±5．6569a 58±2．8284abc 45±2．8284d 45±4．2426d 50±1．4142cd 55±2．8284bc
表 2 中 的 数 据 可 以 看 出 ， 蔗 糖 浓 度 为 10％、 15％的 溶液， 脱脂 乳 浓 度 10％、 15％的 溶 液 ， 谷 氨 酸 钠 浓 度 为 5％ 、 10％ 的 溶 液 ， 乳 糖 浓 度 为 10％、 15％的 溶 液 菌 体 细 胞 存 活 率 比 较 高 ， 结 果 与吕加平， 骆承庠的研究结果相似。 在单因素的 条 件 下 ， 最 好 的 保 护 剂 是 浓 度 为 5％谷 氨 酸 钠 溶 液， 其保护效果可以达到 64％。 考虑到乳糖和蔗 糖同属于糖类， 其保护机理应当相似， 而蔗糖与 乳糖在浓度一样的情况下， 蔗糖溶液的保护效果
2 0 1 0 第1期
广东奶业
乳与乳品
乳酸菌冷冻保护剂的选择
杜磊 1，乔发东 2 （1． 安阳工学院生物与食品工程学院，河南安阳 455000；
2． 河南工业大学生物工程学院，河南郑州 450000）
摘要：乳酸菌浓缩发酵剂的制备过程中，冷冻对菌体的损伤比较明显。 通过在保加利亚乳杆菌和嗜热 链球菌混菌菌悬液中添加不同的保护剂并测定冷冻前后乳酸菌菌数，筛选出适用的保加利亚乳杆菌和嗜 热链球菌混菌的保护剂。 最终确定的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混菌保护剂配方为：蔗糖浓度为 10％， 脱脂乳浓度为 10％，谷氨酸钠浓度为 5％。 菌体经冷冻处理后，冷冻存活率可达到 95．00％，比不添加保护剂 的菌体存活率大大提高。 此配方也简单易得，完全可以满足生产需要。
輥輵讂
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广东奶业
信息文摘
编者按： 广东省畜牧推广总站 《关于下发 2009 年广东奶牛良种补贴项目 牛冷冻精液供应计划的通知》 （粤牧技 ［2010］ 2 号） 已经下发到各地市农业 局畜牧兽医处， 鉴于很多奶牛牛场不知道编号规则， 现将 2008 年广东省奶牛 编号规则刊登， 以供参考。
3 结论 用此配方制备的保护剂对保加利亚乳杆菌和 嗜热链球菌混菌保护效果良好， 并且方便易得， 在工业化生产乳酸菌浓缩发酵剂时也可使用。 参考文献 （略）
輥輯讂
单因素保护剂试验结果见表 2．
数 ／ 冷冻前溶液中的活菌数） ×100
表 2 保护剂单因素试验结果（n＝2）
保护剂 5％蔗 糖 10％蔗 糖 15％蔗 糖 5％脱 脂 乳 10％脱 脂 乳 15％脱 脂 乳
混 菌 冷 冻 存 活 率 （％） 55±2．8284bc 60±4．2426ab 62±4．2426ab 36±2．8284e 51±2．8284cd 58±4．2426abc
表 1 保护剂正交设计表
序号 名称 水平 1（％） 水平 2（％） 水平 3（％）
1 蔗 糖 （A）
10．0 12．5 15．0
2 空 列 （D）
3 脱 脂 奶 （B）
10．0 5．0 7．5
4 谷 氨 酸 钠 （C）
5．0 7．5 10．0
1．2．2 测定方法
2 结果与分析
冷 冻 存 活 率 （％） ＝ （冷 冻 后 溶 液 中 的 活 菌
成的保护剂的保护效果还不如单因素的保护效果 好， 这可能是由于保护剂的配比不合理所致， 但 效果都比对照组 （不添加保护剂） 好。 效果最好 的保护剂配方是蔗糖浓度为 10％， 脱脂乳浓度为 10％， 谷氨酸钠浓度为 5％， 冷冻后菌体细胞的混 菌冷冻存活率可达到 95．00％， 用显微镜观察杆菌 球 菌 比 例 维 持 在 1： 1～1： 1．5， 比 例 与 原 样 中 杆 菌和球菌的比例略有升高， 这主要是由于保加利 亚乳杆菌是对冷冻干燥敏感的菌种， 而嗜热链球 菌对冷冻的敏感程度相对较低。 冷冻时， 培养液 中杆菌的死亡率比球菌高。
1 材料与方法 1．1 材料与试剂
輥輴讂
2 0 1 0 第1期
广东奶业
乳与乳品
1．1．1 MRS 固体培养基： 蛋白胨 1％， 牛肉膏 1％， 酵母膏 0．5％， 葡萄糖 2％， 吐温 80 1ml， 磷酸 二氢钾 0．2％， 醋酸钠 0．2％， 柠檬酸三铵 0．2％， 硫 酸镁 0．02％， 硫酸锰 0．005％， 琼脂 1．5％。
比乳糖溶液的保护效果明显更好， 且蔗糖易得 到， 而乳糖的成本也较高， 所以选择蔗糖进行正 交试验。
以上物质可能有协同的保护作用， 所以设计 了 4 因素 3 水平的正交试验 （正交设计表见表 1）。
正交设计后的冷冻存活率的试验结果见表 3。 对表 3 中的数据进行正交方差分析， 各列的 级差 分 别 为 ： 37．88、 18．99、 19．29、 13．89， 空 列 （第 2 列 ） 的 级 差 并 没 有 比 其 它 （下转第 11 页）