动物克隆-PPT课件

放入CO2培养 箱中保温培养
细胞克隆（动物克隆培养法）
克隆培养法（细胞克隆）——获得细胞株的方法
把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁 衍成一个新的细胞群体的技术
结果 获得纯系细胞（遗传单一，表现相似） 最基本要求 保证所建成的克隆来源于单个细胞 提高细胞克隆形成率的措施
•选择适宜的培养基 •添加血清 •以滋养细胞支持生长 •激素刺激
原代培养、传代培养、细胞系和细胞株
原代培养 将组织细胞分离后，置于第一个培养瓶中培养的 过程（有时也指细胞分裂10次内的培养） 营养消耗，接触抑制 不能继续增殖 传代培养 将培养的细胞分离后，分装到多个培养瓶中培 养继续培养的过程 细胞系 传代培养后可连续 有限细胞系 传代次数有限 连续细胞系（无限细胞系） 传代的细胞 连续细胞系特点： • 细胞发生了转化 （遗传物质改变），多数具有异倍体核型 • 有的只具有不死性，但仍保留接触抑制和无异体致癌性；有 的不仅有不死性，还具有异体致瘤性 有限细胞株 细胞株 通过一定的选择和纯化方法，从原代培养 物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞 连续细胞株 特点：细胞具有恒定的染色体组型、同功酶类型、病毒 敏感性和生化特性等
动物细胞培养
将动物体内部分组织取出，分散成单个细胞后，放 在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖 机械方法或 体外控 组织细胞分 制条件 细胞 切取动物 胰酶消化 散为单细胞 培养 组织块
细胞保持生长、分裂、接触抑制和有规律的衰老、 死亡等生命活动现象
动物组织培养
动物组织在体外及人工条件下维持生活状态或生长 特性
核移植入去 核卵细胞
取出细胞核 （2N）
取乳腺细胞
营养限制性 培养
“多莉”克隆成功的原因和意义
成功的原因（哺乳动物体细胞克隆最复杂）
•重组卵细胞最初分裂时仅复制DNA，而不进行基因转
动物组织培养的基本方法和过程
动物组织培养的一般流程
幼龄动物：生命力 旺盛，分裂能力强 分解细胞外的胶原 纤维和其他成分
取动物组织块
剪碎组织
胰蛋白酶处理分 散成单个细胞 震动 加培养液制成 细胞分散、充分 接触营养液 细胞悬浮液
转入培养液中进行原代培养
贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理 分散成单个细胞，制成细胞悬液 分装到多个培养瓶 中进行传代培养
第二章 克隆技术
第三节 动物的克隆
动物克隆的基础是动物细胞培养和组织培养 细胞培养是研究细胞结构和生理的主要手段
动物细胞培养和组织培养 动物组织培养技术的发展 动物组织培养的基本方法和过程 动物克隆培养法（细胞克隆） 动物的克隆繁殖 动物细胞融合和单克隆抗体的制备 课堂练习
动物细胞培养和组织培养
动物难以克隆的根本原因
细胞高度分化导致基因组中基因的活动很不完全
基因调控合成专 个体发育 一性调控蛋白质
的细胞
有些基因开放 或活动加强 部分基因关闭
基因选择 性表达
使关闭基因恢复表达能力的思路
•给予或消除细胞能调控基因表达的物质并具有适宜
营养条件
•卵细胞中可能具备让所有基因恢复表达的条件
细胞核移植实验
动物细胞培养和组织培养的关系
动物细胞培养和组织培养的关系
•细胞培养中，培养液中各细胞彼此相互依存，细胞培
养的后代在某种程度上会表现出一定的组织特性
•组织培养中，长期的组织培养往往只能使单一类型的
细胞保存下来，而成为简单的细胞培养 细胞培养
统称为组织培养
各种生物体结构 成分的体外培养
组织培养
器官培养
利用一个细胞的细胞核（供体核）来取代另一细胞中的细 胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞）的过程
方法
显微注射和高效细胞融合方法 •将体细胞核或胚胎细胞核移植大去核卵细胞中，是使 这些细胞核恢复全能性表达的基本途径 •用核移植的方法得到的动物称为克隆动物 胚胎细胞核移植（易成功）
1981年，克隆鼠
动物克隆的意义
动物细胞全能性的表现程度
同一动物不同时期和不同部位的细胞，全能性表达程度不同
全能细胞 具有全能性，具有使后代细胞形成完整个
体的潜能。如：受精卵及早期胚胎细胞 多能细胞 只具有分化出多种组织细胞的潜能。如：多 能造血干细胞 专能细胞 只能分化为一种细胞。如：单能造血干细胞和 表皮生发层细胞 特化细胞 不再分化为其他细胞。如成熟的红细胞 注意： 1、低等动物细胞的全能性一般比较容易体现 2、特化细胞的细胞核中仍然具有完整的基因组， 仍具有全能性
类型（以哺乳动物的克隆为例）
胚胎克隆
体细胞核移植（难度高） 体细胞胎克隆 2019年，克隆羊“多莉”
“多莉”的克隆过程
过程
2019年
苏格兰罗斯林研究所 维尔穆特
取卵细胞 胚胎 移植 去除细胞核（N） 去核卵细胞
苏格兰黑 面母羊
白色芬 兰母羊
分裂至8 体外胚胎 另一苏格兰 细胞胚体 培养 黑面母羊 妊娠、 “多莉” 分娩 核DNA与白色 芬兰母羊相同
用途
•使用CO2培养箱调节PH
只有对培养环境有较大 适应范围和具有较强独 立生存能力的细胞，才 容易做细胞克隆。如： 无限细胞系
从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系， 来研究某些蛋白质的功能
动物的克隆繁殖
动物细胞全能性的表现程度
动物难以克隆的根本原因 细胞核移植实验和动物的克隆繁殖 细胞核移植实验 “多莉”的克隆过程 “多莉”克隆成功的原因和理论意义
•1950年
人工培养液“199”研制成功
•1943~1951年之后
能无限传代的细胞系和细胞株培养成功 L—细胞系 HeLa细胞系
贴壁生长和接触抑制
贴壁生长
在细胞体外培养中，动物细胞 会粘附于介质上，成单细胞层 紧贴生长
接触抑制
在离体条件下源自文库正常的动物细胞分裂 生长到表面相互接触时，就会停止分 裂增殖的现象 与细胞表面的糖蛋白有关
动物细胞培养不能像植物组织培养那样最终培养成新个体
动物组织培养技术的发展
•1885年 •1903~1907年
鸡神经板“生理盐水”培养存活
用血清、腹水和淋巴液作为培养基 （含各种营养成分、生长因子并维持 渗透压），使细胞在体外长期存活并 生长——悬浮培养法 用鸡胚浸出液作为添加剂，进行原代培 •1912年 养和长期的传代培养 细胞培养瓶（卡氏瓶）发明