DC细胞的分离及培养

DC细胞的分离及培养

一、单个核细胞的分离

1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。

2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。

3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。

4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。

5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。

6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。

7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。

8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。

9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心

10 分钟，丢弃上清液。

10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。

二、CD34阳性细胞分选

1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。

2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。

3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。

4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。

5. 把重悬后的细胞和磁珠缓缓加到分选柱上，使其缓慢流下。

6. 用分选buffer清洗分选柱3个柱体积。

7. 将分选柱自磁极上取下，加入一个柱体积的分选buffer，快速将之打入离心管中。为提高回收效率，可重复一次。

8. 将洗下的细胞以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并用PBS重悬。

9. 重复步骤8并用合适的培养基重悬以适应下面的细胞培养。

三、CD34阳性细胞培养

1. 培养基配置：IMDM培养基+10% FBS，细胞因子SCF 50 ng/ml、IL-3 5 ng/ml、IL-6 20 ng/ml、FL-3t 50 ng/ml、TPO 20 ng/ml，加双抗。

2. 将分离好的CD34阳性细胞置于六孔版的一孔或分于两孔中（视血量和细胞量

而定），每孔加入2 ml培养基，吹吸混匀，置于37°C、5% CO2下培养。

3. 一周后按照1：3的比例将接种的细胞传于六孔板的其它孔中。

4. 再一周后，将六孔版中的每3孔细胞传于一个10 cm盘中。

5. 之后一周两次对于10 cm盘中的细胞进行传代，稀释比例为1：2或2：3，视细胞密度而定。

6. 传代至5-6周，细胞数目和状态都已至巅峰，可进行其它实验。培养时间不建议超过6周，否则细胞状态难料；如果细胞量不足，最多延长至7周。

四、BCG处理细胞

1. BCG使用前提前2周左右接菌，生长至对数期较好。

2. 对于BCG计数，OD600为1时，1 ml菌液的细菌个数为3*108。

3. 取合适数目的BCG菌液，8000 g离心5 min，弃上清，用PBS或细胞培养基重悬菌体。

4. 按照细胞与细菌1：10的数目比加入BCG，混合均匀。可同时加入少量LPS 以刺激DC的成熟。

5. 培养24-36 h后，收细胞，并进行后续实验。

五、肽的萃取及鉴定

1. 加入PBS溶液重悬细胞，超生1 min以破碎细胞（或直接使用8 M脲溶解细胞）。15 000 g高速离心去除细胞碎片，取上清置于新的离心管中。

2. a) 加入MHC2的抗体，4 °C混合4 h。

b) 加入5倍体积的冷甲醇，12 000 rpm离心5 min，弃沉淀，取上清。

3. a) 继续加入已处理好的Protein A/G的beads，4 °C混合4 h。

b) 用旋转蒸发仪挥去甲醇，浓缩至原始体积。

4. a) 离心beads，清洗后，用酸性HAc-NH4Ac洗脱，过HLB柱子除盐。

b) 如不含脲可进一步浓缩，过HLB柱子除盐。

5. 除盐后洗脱液挥干再复溶，上LC-MS/MS分析。

6. 质谱结果使用无酶搜索，分析数据。