十二常用血细胞化学染色

实验十二常用血细胞化学染色

Cytochemistry stain for blood cells

一、过氧化物酶染色

染色原理

粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO),能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。

试剂器材

1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。

2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。

3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。

4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。

5．瑞氏(Wright)染色液。

6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染色架、洗耳球、光学显微镜等。

操作步骤

1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁氰化钠饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。

2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氰化钠饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染色6min。3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。

4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。

注意事顶

1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。

2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H202过浓。若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。

4．染色液pH应为5.5。

5．试剂应置于低温暗处，防止因光线照射而失效。

实验评价

1．POX染色是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染色方法，临床上不管是哪种急性白血病，首先做POX染色，以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。在判读细胞POX 染色结果前，要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。2．POX阳性说明是急性髓细胞白血病(阳性较强常见于急性粒细胞白血病，弱阳性常见于急性单核细胞白血病)；阴性说明各种急性白血病的可能性均有。因原始细胞多表现为阴性反应，故本法对白血病的分型有一定的局限性，特别是对某些分化极差的白血病，可能失去鉴别意义。

3．四甲基联苯胺法操作简单，染色效果较好，试剂无致癌作用，但对染液pH要求较高，如pH<5.0会导致假阳性结果。

二、氯乙酸AS-D荼盼醋酶染色

染色原理

血细胞内的氯乙酸AS-D荼酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase, NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D荼酚，产生AS-D荼酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有色沉淀为红色。

试剂器材

1．10%甲醛甲醇固定液

甲醛25mL

甲醇75mL

混合后置4℃冰箱保存。

2．Veronal醋酸缓冲液

甲液：

醋酸钠(含3H2O) 1.94g

巴比妥钠 2.94g

蒸馏水100mL

乙液：

0.1mol/L盐酸取盐酸(比密1.190g/L)0.85mL加蒸馏水至100mL。

取甲液50mL，乙液45mL，再加蒸馏水135mL，用1mol/L盐酸调pH 至7.5~7.6。

3．基质液

氯乙酸AS-D荼酚100mg

丙酮0.5mL

蒸馏水5mL

Veronal醋酸缓冲液5mL

固酱紫GBC盐10 mg

不必过滤立即染色，一次用完。

4．苏木素染液。

操作步骤

1．固定新鲜干燥的涂片在固定液中30 s~1min，蒸馏水冲洗，待干。2．显示放入基质液(37℃)30min，自来水冲洗。

3．复染苏木素染液复染5mn，自来水冲洗，待干，镜检。

注意事顶

1．冬季室温低，茶酚和固酱紫GBC盐不易溶解，可放37℃温箱促溶。2．茶酚在丙酮中溶解后再加其他液体。

3．NAS-DCE不被氟化钠抑制。

4．此酶染色后的标本易脱色，不能长期保存。

实验评价

NAS-DCE阳性反应几乎仅出现在粒细胞、较POX染色更具有特异性，因此又称为"粒细胞酯酶"、"特异性酯酶"。故该酶较特异地识别粒细胞系，有助于急粒和急单的鉴别，特别是对某些POX反应较强的单核细胞白血病鉴别意义更大。

三、α一醋酸荼盼醋酶染色

染色原理

血细胞内的α-醋酸荼酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase,α-NAE)在pH中性的条件下可水解基质液中的α-醋酸荼酚，释放出α-荼酚与基质液中的重氮盐偶联形成不溶的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐对坚牢蓝B，形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染色时，通常同时做氟化钠抑制试验。

试剂器材

1．0.067mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)。

甲液：Na2HPO4·12H2O 2.388g加蒸馆水至100mL。

乙液：KH2 PO4 0.908g加蒸馏水至100 mL。

取甲液87mL，乙液13mL混合，调pH至7.6。

2．基质液0.067mol/L磷酸缓冲液50 mL，加10g/Lα-醋酸荼酚(用50%丙酮为溶剂)1.0mL，充分振荡，直至最初产生的混浊物(大部分)消失为止，加重氮盐(坚牢蓝B等)50mg，振荡，过滤后立即使用。

3．10 g/L甲绿水溶液。

操作步骤

1．固定新鲜干燥涂片置10%甲醛生理盐水中5min，自来水冲洗5min，待干。

2．显示放入基质液(37℃)1h，自来水冲洗。

3．复染l0 g/L甲绿水溶液复染5~15min，自来水充分冲洗，待干，镜检。4．氟化钠抑制试验在1mL基质液中加入1.5mg氟化钠，其余按本染色法进行，染色步骤同上。

注意事顶

1．标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。

2．重氮盐的选择依次为坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B的染色效果为好。实验评价

1．α-NAE染色是一种非特异性醋酶染色，是判断急性白血病的常规染色方法，在中性pH时用α-NAE作底物，正常单核细胞和原始单核及幼稚单核细胞均呈阳性反应，不被氟化钠抑制；其他血细胞则呈阴性或弱阳性反应，故α-NAE又称"单核细胞酶"，结合氟化钠抑制试验，对鉴别单核细胞白血病有重要价值。

2．有时单系细胞或粒系细胞、淋系细胞阳性较弱，因此难以判断加氟化钠后的抑制情况，且有时阳性细胞是由于假阳性所致。

四、过碘酸-雪夫染色

染色原理

过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基(-CHOH-CHOH)的多糖类物质(糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪夫试剂中的无色品红结合，使其变成紫红色，定位于细胞内的多糖所在处。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再糖原染色，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其他多糖类物质。过碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff reaction, PAS),以前又称为