杂质检查方法的方法学验证各项指标分析汇总

杂质检查方法的方法学验证各项指标分析

学号：20120262 姓名：王芳

药物分析中药品检验基本程序包括：鉴别、检查、含量测定、写实验报告等步骤。

检查项下包括反映药品安全性有效性的试验方法和限度、均一性、纯度等制备工艺要求等内容。药物的杂质是指药物中存在的无治疗作用或者影响药物的稳定性、疗效,甚至对人体的健康有害的物质。杂质的来源可由生产和贮藏过程中引入：①生产过程中主要是由于所用原料不纯或者原料反应过程中反应未完全,以及反应的中间产物、反应的副产物等造成药品原料中杂质的存在；或者是由原料生产过程中反应的溶媒、催化剂等溶剂的残留所造成的药物的杂质。②贮藏过程引入主要是受温度、湿度、日光、空气等外界条件的影响或者受微生物的作用产生的杂质[1]。在药物的研究、生产、贮存和临床应用等方面, 必须保持药物的纯度, 降低药物的杂质,这样才能保证药物的有效性和安全性[2]。

原料药和制剂主要是对药物中的微量杂质进行纯度检查，以判断药物纯度是否符合杂质限量的规定要求，而生物制品的杂质检查除包括一般杂质检查，特殊杂质检查外还应对其进行安全性检查。杂质定量、定性检查方法主要是根据药物和特殊杂质在理化性质上的差异来进行的，可以采用容量分析法，光谱法分析法，色谱分析法等[3]，各种检测方法所需的方法学验证的指标包括准确度，精密度，专属性，线性，范围，检测线、定量线，耐用性八项指标，但采用不同方法所需的指标不尽相同，杂质限量检查一般需要验证专属性，检测线，耐用性。而杂质定量分析方法除检测限外其它指标一般都需验证[4]。

不同实验应该根据不同实验目的对对各项指标进行验证，下

面就杂质种类及近年来检测杂质最常用的检测方法进行分析：

1、特殊杂质

特殊杂质是指在药物制备和贮存过程中, 由于药物性质不稳定而产生的降解产物, 或合成过程中产生的副产物等, 多指有机杂质, 也包括残留溶剂和手性化合物中无特殊毒性的对映体[5]。

1.1 HPLC 法测定萘普生缓释片有关物质的含量[6]：该缓释片主药是萘普生，特殊杂质为（6－甲氧基－2－萘乙酮)，方法采用高效液相色谱法(HPLC) 法; 色谱柱: 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂; 以0.05mol /L 的磷酸二氢钾－甲醇-乙腈( 40: 25: 35) 磷酸调节PH至3.0为流动相; 检测波长为240nm; 流速:1.0ml /min; 进样量: 10μl .

1.1.1系统适应性：首先针对高效液相色谱法应进行系统适应性指标（理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子）验证，该实验得出萘普生主峰与已知杂质峰( 6-甲氧基-2-萘乙酮) 分离良好，萘普生主峰理论半数大于5000，符合规定。

1.1.2精密度考察:精密度考察主要有三个层次包括日内精密度，日间精密度以及重现性考察，一般受条件限制只进行前两者的指标验证。本实验针对色谱条件对样品对照品及杂质对照品进行检测是对日内精密度的一个考察，也可以看成是对高效液相法色谱条件系统适应性实验的一个指标验证。

取萘普生对照品和已知杂质对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml 约含萘普生0.25mg 和已知杂质0.25μg 的混合对照品，取上述混合对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6 次，记录色谱图，结果萘普生与已知杂质主峰面积的RSD 分别为0.12%和0.17%，说明该色谱条件精密度良好。

1.1.3重复性考察:如上同样是对日内精密度进行指标验证，但是此处重复性考察是对包括已知杂质在内的所有杂质以及主药进行的一个方法学指标验证。

取地奥集团成都制药有限公司的萘普生缓释片细粉( 约相当于含萘普生25mg) 6份及已知杂质对照品适量，配制供试品溶液和对照溶液，精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，已知杂质按杂质对照品法计算含量，其他杂质以萘普生主成分自身对照法计算含量，由试验结果表明，6份供试品溶液中总杂质的平均值为0.365%，RSD为0.93%，最大杂质的平均值为0.057%，RSD为2.41%，同时未检出已知杂质，说明拟定的色谱条件重复性好。

1.1.4专属性实验：专属性试验主要是验证空白液与供试品有无杂峰，及出峰时间，得分离度是否符合要求；供试品与杂质对照品出峰时间，计算分离度是否符合要求；已知杂质与其他杂质出峰时间及分离度是否符合要求。

①辅料干扰试验: 取供试品溶液和空白辅料溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，试验结果显示辅料不干扰样的有关物质检查。②破坏性试验:分别用酸、碱、氧化、高温、光照条件对供试品进行破坏性试验。由试验结果得，供试品经破坏后，主峰与各杂质峰之间，已知杂质与其他杂质峰之间分离度均大于1.5，说明该方法专属性较好。专属性试验主要是

1.1.5检测限实验：检测限是定性分析指标，无限稀释对照品，直至信噪比S/N=3时的最低浓度或量，主要用来验证该方法的灵敏度。该实验分别对萘普生对照品及已知杂质对照品进行方法指标验证

取萘普生对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1ml 含0. 0103μg 的溶液，作为萘普生检测限溶液。取已知杂质( 6-甲氧基-2 -萘乙酮) 对照品适量，配置0.0168μg /mL 的溶液，作为已知杂质( 6-甲氧基-萘乙酮) 检测限溶液，精密量上述两溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，得两者检测限

0.103ng和0.168ng。

1.1.6溶液稳定性考察:耐用性考察是指在测定条件有小的变

动时，测定结果不受影响的承受程度，一般包括对溶液的稳定性，样品提取时间、次数以及仪器型号和条件（流动相组成，比例，柱温，流速等）的改变进行考察，该实验是对溶液的稳定性来实现：

取同批号的萘普生缓释片细粉( 约相当于含萘普生25mg) 及已知杂质对照品适量，精密称定，配制供试品溶液和对照溶液，精密量取供试品溶液和对照溶液各10μl，在0 、2、4、8小时，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果供试品溶液放置8h，其最大杂质含量的RSD 为2.28%，总杂质含量的RSD 为1.58%，同时未检出已知杂质，表明供试品溶液在8小时内基本稳定。

药典对萘普生样品对照品及已知杂质对照品的含量测定方法均有记载，然而该实验无需载进行线性和范围及定量限的方法学验证。但是该实验未对准确度考察是方法学指标验证的不完整性。

1.2 苯磺酸左旋氨氯地平片中右旋杂质的检查[7]:

该实验验证专属性，标准曲线、范围、检测限及定量限，稳定性实验（耐用性），精密度与重复性实验，回收率实验八项指标，虽然在未在指标验证中做系统适应性实验，但在讨论中提到最佳检测波长，最佳色谱条件

1.2.1 专属性试验：分别以空白辅料C :20μL,左旋体B: 20μL，含1%右旋体A :20μL，注入色谱仪，由AB得左旋体保留时间38.6min, 右旋异构体43.4min,两色谱峰的分离度符合要求;表明在右旋体保留时间处无杂峰, 说明对测定无干扰。见图1。