蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化

➢ 操作手段：
（１）降低氯化镁的浓度；
（２）是添加氯化锰
（３）是降低其中某一种单核苷酸的浓度或者 用核
苷酸三磷酸盐类似物替代其中一种单核苷酸
➢ 关键：选择适当的突变频率
➢ 优点：快速、简便、操作方便
➢ 缺点：它比较费力耗时,一般适用于较小的基因片段( <
800bp） 3
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2 error-prone PCR（易错PCR）
蛋白质异源表达及其稳定性的定向进化
0 内容
1 蛋白质的定向进化 2 定向进化的方法 3 定向进化的筛选 4 蛋白质定向进化的应用前景
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2 蛋白质的定向进化方法
error-prone PCR（易错PCR） DNA shuffling (DNA改组) 体外随机引发重组
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2 error-prone PCR（易错PCR）
a．用单链DNA为模板，对模板量要求少，大大降低了 亲本组分，便利筛选；
b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底 去除DNase I的缺点；
c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容，组 装前无需纯化操作；
d．随机引发DNA合成不受模板DNA长度的限制，便利了 小肽的改造。
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error-prone PCR
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2 DNA shuffling (DNA改组)
DNA改组 ( DNA shuffling )又称有性 PCR ，是将一群密切相关的序列 ( 小片段，这 些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它 们通过自身引导 PCR延伸，并重新组装成 全长的基因。
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3 噬菌体展示筛选技术
➢噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融 合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，利 于蛋白酶的催化或蛋白分离
➢同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使 得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在 一起。
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3 噬菌体展示筛选技术
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谢谢大家！
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➢手段: 高通量筛选体系和超高通量筛选体系建立。（对比以前 的挑单菌落摇瓶复筛，筛选数目多，试剂少，信号灵敏，自动化 程度较高）
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3 蛋白质定向进化的筛选
常用的筛选方法：
利用底物显色反应 改变培养条件(如逐步提高培养温度, 或改变培养基 的pH 等) 利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光 高通量筛选(HTS: High Throughout Screening) , 该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛 选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等。
➢ 概念：利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行 随机诱变的技术称为易错PCR（error-prone PCR）。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
➢ 原理:通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP d低C保TP真d度TT的P T的aq浓D度NA并聚且合加酶入。一使定基量因的在M扩nC增l2时，能同随时机采的用 创造突变。遗传变化只发生在单一分子内部,故属于无性 进化(asexual evolution)
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2 体外随机引发重组
体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合一套随机 引物，产生互补于模板不同位置的短DNA片段库(由于碱基 错配，这些短DNA片段也含有少量的点突变)，然后进行类 似于DNA shuf外随机引发重组具有以下优点：
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2 DNA shuffling (DNA改组)
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2 基因家族之间的同源重组Family shuffling
➢ Family shuffling 指用DNA shuffling 技 术, 改组进化上相关的一系列基因。 ➢ 当从自然界中存在的基因家族出发, 利用它 们之间的同源序列进行DNA 改组。由于每一个 天然酶的基因都经过千百万年的进化, 并且基 因之间存在比较显著的差异, 所以获得的重组 基因库充分体现了基因的多样化，又最大限度 的排除了那些不需要的突变。
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3 利用底物显色方法筛选
➢颜色变化是最简便的追踪酶反应的方法， 如用对硝基苯基衍生物检测水解酶的活性。 根据水解释放出的黄色对硝基苯酚或对硝基 苯胺来进行检测。下图显色底物可检测葡萄 糖苷酶。 ➢碱性条件显色pH8 ➢大多数酶并不能直接引起颜色变化，为了 检测一个没有生色集团的底物的反应，需要 将反应产物转变为一个有色化合物。
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3 改变培养条件进行筛选
根据细胞生长情况筛选突变基因：
➢提高培养温度 ➢抗生素 ➢改变培养基的pH ➢高渗透压 ➢低温 ➢有毒物及抑制剂
OD-Monitor OD值测定传感器
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1 利用蛋白质的固有性质（荧光标记）
➢荧光检测法具有灵敏性高、方法简便的优点， 在高通量筛选中被广泛应用，该方法可以使用很 稀的底物浓度和极少量的催化剂进行检测。
2 体外随机引发重组
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3 定向进化的筛选
➢蛋白定向进化最核心的部分在于建库的多样性和筛选的高效性。 筛选过程首先是将突变基因进行分离并尽可能多地表达成蛋白质 ， 其次是将蛋白质的活性通过亲和、催化或报告基因等方式表现为 可检测的形式，最后是将符合要求的蛋白质分离出来。
➢在定向进化中尽管突变体具有随机性，但通过选择特定方向的 突变限定了进化趋势，加之控制实验条件限制突变种类降低突变 率缩小突变库的容量，不仅减少了工作量更重要的是加快了酶在 某一方向的进化速度。