浅谈分子定向进化技术

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2.原理
在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用 TaqDNA多聚酶不具有3’ 一5 ‘校对功能的性质， 配合适当条件，以很低的比率向目的基因随 机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择 方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从 而排除其他突变体 。分子定向进化其实是突
变加筛选／选择的重复循环，且整个进化过 程完全是在人为控制下进行的。
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四.展望
伴随着分子生物学新理论和新技术的发展， 分子定向进化的新方法和新技术必将会不 断涌现，层出不穷，必将会出现更多更好 的新方法，解决更具体的问题，取得更大 的进步。
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Байду номын сангаас
（1）.噬菌体展示技术(Phage Display)
噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选 的方法。人们利用这一技术可以将各种自然界或人 工合成的DNA整合到丝状噬菌体基因中，以融合蛋 白的形式表达在噬菌体表面，利用噬菌体展示库所 固有的基因型和表现型之间的直接关联进行检测。 如抗原抗体反应，生物素结合反应等，根据反应的 性质进行分离，从中筛选出人们所需的突变蛋白质。
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2.分子定向技术在农业中的应用
农业饲料酶制剂中的应用：通过易错PCR和 DNA改组技术，获得高比活和低pH淀粉酶； 碱耐受性和在碱性条件下高活性的纤维素酶 ；
耐高温的纤维素酶；水解二糖的能力较野生 型高31％葡聚糖内切酶；温度耐受性超过 90℃，最适pH为酸性的木聚糖酶。
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4.高通量筛选技术(High-Throughput Screening， HTS) 表面展示技术是筛选蛋白质突变体库的 高通量筛选方法，特别在抗体的研究当中应 用非常普遍，具有高效、高灵敏度等特点。 目前，表面展示技术有：噬菌体表面展示技 术，细菌表面展示技术，酵母表面展示技术， 酵母双杂交系统，核糖体展示技术．蛋白质 片断互补试验.
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一.分子定向进化技术
1.分子定向进化技术的定义 分子定向进化(molecular directed evolution)是
在分子水平研究所需生物的特定基因或蛋 白质，可以在试管里进行无性繁殖或有性 繁殖，其实质是达尔文进化论在分子水平 上的延伸和应用，是在体外模拟突变、重 组和选择的自然进化机制，使进化朝着人 们需要的方向发展。
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二.分子定向进化的选择策略
1.致错PCR(error—prone PCR，epPCR)技术 是指在利用Taq酶进行PCR扩增目的基因的 同时引入碱基错配，导致目的基因随机突 变。
2. .盒式突变(cassette mutagenesis)技术 即寡核 苷酸介导的诱变技术，是用一段人工合成 具有突变序列的DNA片段，取代野生型基 因中的相应序列。
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（2）.细菌细胞表面展示技术(Bacterial
CellSurface Display)
结合荧光激活细胞筛选仪(Fluo．rescence Activated Cell Sorting，FACS)或流式细胞筛选 仪(flow cytometry)是非常有效的高通量筛选 方法 . 该技术是目前惟一能够定量检测单细 胞水平和大量突变体酶催化活性的方法。它 能够决定突变体库中每个克隆的功能特性 。
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3. DNA改组(DNA shuffling)技术，又称有性
PCR(sexualPCR)或分子育种(molecular breeding)， 即DNA分子的体外重组。通过DNA shufling技 术，既可对单基因或DNA片段进行改组，也可 对基因组或染色体等进行改组 。
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三 .分子定向进化技术的应用
1.在治理环境生物污染方面的应用
有机磷的降解，Cho等通过两轮的DNA改组 和筛选，分离得到可提高降解甲基对硫磷 的突变体，其中典型的突变体为22A11，水 解甲基对硫磷的能力较野生型提高了25倍。
诸如此类还有对三氯丙烷、 三氯乙烯、五 氯苯酚的降解.
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3. 在蛋白质药物上的应用
对酶类药物的定向进化，主要体现在提高活 性和增强稳定性上。
使用DNA改组技术对人DNA拓扑异构酶的 碳末端进行定向进化。筛选到的突变体，对 喜树碱的敏感性比野生型的提高了22～28倍。
对血纤维蛋白溶酶原催化抑制1(plasminogen activator inhibitor type 1．PAI一1)进行改组， 筛选到的突变体的半衰期比野生型的提高了 245倍，突变位点在50，56，61，70，94， 150，222，223，264和331。
浅谈分子定向进化技术
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前言
分子定向进化又称实验室进化或进化生物 技术，它在体外模拟自然进化机制，使进 化朝着人们需要的方向发展。近年来，分 子定向进化技术研究和应用的领域逐渐扩 大，涉及基因治疗、医学诊断、食品和化 学工业等各方面。随着各种新型突变技术 和新型检测系统的出现，分子定向进化技 术研究将向纵深发展。