Aβ在两种阿尔茨海默病转基因小鼠模型脑杏仁核分布的比较研究

２０１４年１０月第３７卷第５期

湖南师范大学自然科学学报

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｏｆＨｕｎａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

Ｖｏｌ．３７　Ｎｏ．５

Ｏｃｔ．，２０１４Ａβ在两种阿尔茨海默病转基因小鼠

模型脑杏仁核分布的比较研究

周　奕１，邓志伟１，艾卫敏２，朱耀峰３，张剑峰４，卢　璨４，雷德亮５倡

（１．长沙卫生职业学院基础学科部，中国长沙　４１０１００；２．湘潭职业技术学院护理学院，中国湘潭　４１１０１２；

３．吉首大学医学院，中国吉首　４１６０００；４．中南大学湘雅医学院，中国长沙　４１００１３；

５．中南大学基础医学院，中国长沙　４１００１３）

摘　要　目的：比较研究Ａβ在两种ＡＤ转基因小鼠模型脑杏仁核分布的差异．方法：采用１８月龄雄性ＡＰＰ／ＰＳｌ双转基因（２×Ｔｇ－ＡＤ）小鼠与同龄同性别ＡＰＰ／ＰＳｌ／ｔａｕ三转基因（３×Ｔｇ－ＡＤ）小鼠，分别进行６Ｅ１０单克隆抗体免疫组化染色等方法显示Ａβ阳性神经元及斑块，观察其分布与形态等的差异，图像分析系统定量比较其量的变化．结果：在杏仁核２×Ｔｇ－ＡＤ组Ａβ阳性产物主要位于细胞外成为细胞外Ａβ（ｅＡβ），形成大量的Ａβ阳性斑，Ａβ阳性神经元少；而３×Ｔｇ－ＡＤ组Ａβ阳性产物主要位于神经元细胞内，成为细胞内Ａβ（ｉＡβ），但Ａβ阳性斑少见．结论：２×Ｔｇ－ＡＤ组与３×Ｔｇ－ＡＤ组Ａβ阳性产物在杏仁核分布的差异可能反映了两种ＡＤ小鼠模型神经病理等改变的

不同．

关键词　阿尔茨海默病；转基因小鼠；β淀粉样蛋白；杏仁核

中图分类号　Ｒ７４９畅１６ 文献标识码　Ａ 文章编号　１０００－２５３７（２０１４）０５－００２６－０５

ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＡβｉｎＡｍｙｇｄａｌｅｏｆ

ＴｗｏＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＭｉｃｅＭｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ摧ｓＤｉｓｅａｓｅ

ＺＨＯＵＹｉ１，ＤＥＮＧＺｈｉ－ｗｅｉ１，ＡＩＷｅｉ－ｍｉｎ２，ＺＨＵＹａｏ－ｆｅｎｇ３，ＺＨＡＮＧＪｉａｎ－ｆｅｎｇ４，ＬＵＣａｎ４，ＬＥＩＤｅ－ｌｉａｎｇ５倡（１．ＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＣｈａｎｇｓｈａＨｅａｌｔｈＶｏｃａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０１００，Ｃｈｉｎａ；

２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＮｕｒｓｉｎｇ，ＸｉａｎｇｔａｎＶｏｃａｔｉｏｎａｌａｎｄＴｅｃｈｎｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉａｎｇｔａｎ４１１０１２，Ｃｈｉｎａ；

３．ＭｅｄｉｃｉｎｅＳｃｈｏｏｌｏｆＪｉｓｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｓｈｏｕ４１６０００，Ｃｈｉｎａ；

４．ＸｉａｎｇｙａＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００１３，Ｃｈｉｎａ；

５．ＢａｓｉｃＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００１３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｍｐａｒｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＡβｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｈｅａｍｙｇｄａｌｅｏｆｔｗｏｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅｍｏｄｅｌｓｏｆＡｌｚｈｅｉｍｅｒ摧ｓｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：１８－ｍｏｎｔｈ－ｏｌｄＡＰＰ／ＰＳｌ（２×Ｔｇ－ＡＤ）ａｎｄｔｈｅａｇｅ－ｍａｔｃｈｅｄｍａｌｅｍｉｃｅｏｆＡＰＰ／ＰＳｌ／ｔａｕ（３×Ｔｇ－ＡＤ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．６Ｅ１０ｉｍｍｕｎｏｈｉｓ－ｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｈｏｗｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓｏｆＡβｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｎｄｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｗｅｒｅｍａｄｅｏｎｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｎｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｓｙｓｔｅｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＡβｉｎｔｈｅａｍｙｇｄａｌａｏｆ２×Ｔｇ－ＡＤｗａｓｍａｉｎｌｙｓｅｅｎａｓｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＡβ（ｅＡβ），ａｎｄｆｏｒｍｅｄａｌｏｔｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｑｕｅｓ；ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄａｓｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｌｙＡβ（ｉＡβ）ｆｏｒｔｈｅ３×Ｔｇ－ＡＤ，ｂｕｔｔｈｅＡβｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｑｕｅｓｗｅｒｅｒａｒｅｌｙｓｅｅｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆＡβｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒｏｄｕｃｔｓｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅ２×Ｔｇ－ＡＤａｎｄ３×Ｔｇ－ＡＤｉｓｌｉｋｅｌｙｔｏｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅｔｗｏＡＤｍｏｄｅｌｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＡＤ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅ；Ａβ；ａｍｙｇｄａｌｅ

倡　收稿日期：２０１４－０５－０８

　基金项目：湖南省卫生厅科研基金课题资助项目（Ｂ２０１４－１５１）；湖南省教育厅科学研究资助项目（１４Ｃ００９１）；米塔尔学生创新资助项目（１０ＭＸ１９）；长沙市２０１３年度指导性科技计划资助项目（Ｋ１３ＺＤ０４６－３３）倡通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｌｉａｎｇｌｅｉ＠ｃｓｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

周　奕等：Ａβ在两种阿尔茨海默病转基因小鼠模型脑杏仁核分布的比较研究阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ摧ｓｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）临床上表现为：起病隐袭、进行性发展的记忆、言语、视空间、认知功能减退及人格的异常等［１－２］．其主要病变为：Ａβ异常聚集和沉积形成老年斑（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅｓ，ＳＰｓ）；颞叶、海马、杏仁核等部位神经元及突触丢失；ｔａｕ异常磷酸化导致的神经纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴｓ）和颗粒空泡变性（ｇｒａｎｕｌｏｖａｃｕｏｌａｒｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ＧＤ）等［３－５］．ＡＤ的病因及发病机制复杂，有多种学说，至今仍未阐明．Ａβ学说是目前普遍认同的ＡＤ主要发病机制之一：Ａβ在脑内异常聚集并纤维化形成ＳＰｓ，其神经毒性作用可破坏钙离子平衡、诱发氧化应激、激活小胶质细胞产生炎症反应、激活凋亡相关蛋白等启动凋亡程序并导致广泛的神经元丢失，进而形成认知功能损害，出现相应的痴呆症状［６－８］．用于ＡＤ研究的动物模型有很多种，且各具特点．其中过度表达人类家族性突变的ＡＰＰ基因和ＰＳ１基因的２×Ｔｇ－ＡＤ小鼠，以及过度表达ＡＰＰ、ＰＳ１和ｔａｕ基因的３×Ｔｇ－ＡＤ小鼠均能模拟出ＡＤ的某些神经生物学特征性改变，然而针对这两种动物模型脑内重要区域Ａβ分布的比较还未见报道．本研究通过Ａβ单克隆抗体（６Ｅ１０）免疫组化染色结合形态学分析等方法，比较１８月龄２×Ｔｇ－ＡＤ与３×Ｔｇ－ＡＤ小鼠杏仁核中Ａβ分布的差异，探讨两种ＡＤ小鼠模型病理形态等的不同．

１　材料与方法１．１　实验动物

１８月龄健康雄性２×Ｔｇ－ＡＤ小鼠８只，含有突变的ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１△Ｅ９，由北京利昊生物科技有限公司提供．同龄雄性３×Ｔｇ－ＡＤ小鼠８只，含突变的ＡＰＰＳｗｅ／ＰＳ１Ｍ１４６Ｖ／ｔａｕＰ３０１Ｌ，由美国国立卫生研究院Ｉｎｇｒａｍ博士资助．实验动物在ＳＰＦ（ＳｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎＦｒｅｅ）级环境下饲养，严格控制温度、湿度、光照、换气条件等．高压灭菌的普通膳食喂养，定时称体质量，了解小鼠生长发育情况．１．２　实验方法

１．２．１　组织制备　小鼠用质量分数为４％的水合氯醛按１０μＬ／ｇ腹腔注射麻醉，仰卧位固定于实验台上．于上腹部剪开腹壁，向上紧贴剑突左侧剪破胸壁与膈肌，暴露心脏．在心尖剪一小口，迅速将灌注针经心尖送至升主动脉根部，随后剪开右心耳，可见血液快速流出．先用２０～３０℃０．９％的氯化钠溶液２０～３０ｍＬ快灌，可见肝脏颜色迅速变白，再用４℃的４％多聚甲醛磷酸缓冲液（Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ，ＰＦＡ）（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ＝７．４）５０～１００ｍＬ灌注，前１／３快灌，后２／３慢灌，使ＰＦＡ充分渗透，维持３０～４０ｍｉｎ．灌注过程中可见小鼠尾巴抖动，四肢颤抖，并逐渐变硬．灌注完成后取脑，在４℃的４％ＰＦＡ中固定１２ｈ，然后沉于３０％的蔗糖溶液４ｈ．在－２０℃条件下作连续冠状切片，片厚３０μｍ，收集杏仁核层面切片，待用．

１．２．２　免疫组化　Ａβ单克隆抗体（６Ｅ１０）进行ＡＢＣ法免疫组织化学染色，主要过程如下：８０％的甲酸修复抗原３０ｍｉｎ；１％Ｈ２Ｏ２１５ｍｉｎ去除内源性过氧化酶干扰；０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００１５ｍｉｎ以增加细胞膜通透性；５％的正常山羊血清封闭１ｈ；小鼠抗人６Ｅ１０单克隆抗体（１∶４００）置４℃摇床１２ｈ；生物素化山羊抗鼠ＩｇＧ（１∶２００），室温摇床２ｈ；亲和素－生物素化酶（ＡＢＣ）复合物（１∶１５０），室温摇床上孵育１．５ｈ；二氨基联苯胺（ＤＡＢ）显色５ｍｉｎ，镜下观察并控制染色的强度．以上各步骤之间均用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ漂洗３次，每次５ｍｉｎ；明胶玻片贴片；自然干燥后，０．１％尼氏染液复染，梯度酒精脱水，二甲苯脱脂，明胶封片．阴性对照：用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ代替一抗，排除二抗的非特异性染色，结果为阴性．１．３　数据收集和统计学处理Ｍｏｔｉｃ－Ｋ４００Ｌ显微镜在高倍视野（×６０）下使用ＩＰＰ软件计数杏仁核的相似视野中能够分清细胞轮廓的阳性细胞数，并取其均值．染色深度达到足以区分细胞周界的神经元被计数，全部计数均由一人采用盲法操作完成．每只小鼠脑组织检测３张切片，每张切片检测３个视野．ＨＰＩＡＳ－１０００Ｈ高清晰度彩色图像检测系统测定杏仁核区阳性表达产物的平均灰度值，同时测量各切片背景灰度值．免疫阳性灰度值＝背景灰度值－免疫阳性产物平均灰度值．实验数据以均数±标准差表示．样本均数的比较采用完全随机设计的单因素方差分析并用ＳＰＳＳＶ２０．０统计软件进行统计处理．Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义．

２　结果

２．１　形态学观察

２．１．１　Ａβ阳性神经元　Ａβ阳性神经元轮廓较清晰，细胞胞体较大呈圆形，胞浆中可见灰褐色的免疫阳性７２第５期