免疫球蛋白重链结合蛋白和钙网蛋白在肝细胞癌中的表达与转移的关系(新)

ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ ｔｏ
ｃａｓｅｓ
ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ＣＲＴ ｉｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｊｕｎｅ ２０１４ ａｎｄ Ｍａｙ ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ２０１５． ＣＲＴ ｉｎ
ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ
Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｅｔｉｎ（Ｂｉｐ）ａｎｄ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ（ＣＲＴ） ａｎｄ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｔｉｓ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎｄ ＲＴ．ｑＰＣＲ
与转移的关系。方法采用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹及实时荧光定量ＰＣＲ技术检测Ｂｉｐ与ＣＲＴ在正常肝脏细胞 株及肝癌细胞株表达；收集２０１４年６月至２０１５年５月在郑州大学第一附属医院住院患者手术的肝 细胞癌标本４３例，用免疫组织化学染色和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术检测４３例肝细胞癌组织及相应的癌旁 组织和５例肝血管瘤旁组织中Ｂｉｐ和ＣＲＴ蛋白的表达，并分析与临床病理资料的关系。结果
２．Ｗｅｓｔｅｍ印迹：用ＲＩＰＡ（强）细胞裂解液裂解
胞癌组织中表达及及转移的关系及其机制。
对象与方法 一、对象
细胞并收集，用ＢＣＡ法进行蛋白浓度定量。取相同 蛋白总量进行上样，在１０％聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ—
ＰＡＧＥ）中进行电泳，所得ＰＶＤＦ膜在室温下用５％
１．研究对象：人肝脏细胞株Ｌ０２及人肝癌细胞
肝细胞癌是常见的恶性肿瘤，其复发及转移率 高是阻碍肝癌术后患者获得远期生存的重要因素之 一…。免疫球蛋白重链结合蛋白（Ｂｉｐ）亦称为葡萄 糖调节蛋８－７８（ＧＲＰ７８）是内质网分子伴侣蛋白，是 判定内质网是否应激的重要指标之一心引。研究表 明，内质网应激与肿瘤细胞转移、侵袭密切相关Ｈ引。 钙网蛋白（ＣＲＴ）主要分布于内质网中，是一种多功 能分子伴侣蛋白，参与多种生物学调节功能，如钙平 衡，转录，基因表达，糖蛋白折叠，损伤修复，免疫应
ａｎｄ
ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
Ｈｏｎｇｗｅｉ，Ｙａｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
Ｂｉｎｇ，Ｆｅｎｇ
Ｒｕｏ．４ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｏｆ
ｏｆ
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｊｉａｎｗｅｎ，死昭Ｗｅｎｃｈａｏ，Ｗａｎｇ铂ｎｇ，Ｔａｎｇ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ａｎｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ＆Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎ
ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＲＴ ｗｅｒｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ＣＲＴ ｉＳ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ： Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
Ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ；
ｎｏｒｍａ】ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ．４３ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ｕｓｅｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｔｏ
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
ａｎｄ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ
答和细胞的多种功能（细胞粘连、迁徙、增生、吞噬 和凋亡）∞４ Ｊ。本研究旨在探讨Ｂｉｐ及ＣＲＴ在肝细
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二、方法 １．免疫组织化学染色：按试剂盒ＰＶ－９０００二步
法操作：组织切片常规二甲苯脱腊，梯度乙醇和蒸馏 水进行水化，枸橼酸盐缓冲液高火２ ｍｉｎ，低火１５ ｍｉｎ进行抗原修复，３％过氧化氢去离子水阻断内源 性过氧化物酶，一抗４℃孵育过夜，通用型二抗室温 孵育１５ ｍｉｎ，ＤＡＢ显色处理，苏木精复染，脱水、 封片。
Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ
ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｅｔｉｎ；
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｃｈｉｎａ（Ｕ１２０４８１５）；Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ
Ｔａｌｅｎｔｓ ｏｆ Ｈｅｎａｎ Ｐｍｖｉｎｃｉａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（１４ＨＡｓｌｌｎ．｜０３０）
Ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ａｎｄ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ
Ｆｕ Ｚｈｅ＋，Ｙｅ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｔａｎ Ｐ－洲ｉｎｃｅ．Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００５２．Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ａｕｔｈｏｒ：Ｆｅｎｇ Ｒｕｏ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
相对表达量。
表１各相关基因引物序列
ｏｆ
ａｎｄ
Ｅｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ
Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ
４５０ＤＤＪ，吼ｉｎａ，Ｅｍａｉｌ：斤＠ｚｚＵ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｔｉｓｓｕｅｓ
ａｎｄ ａｌｓｏ ａｄｉａｃｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ＣＲＴ ｗｅｒｅ ８６．０％
ｃａｒｃｉｎｏｍａ
（３７／４３）ａｎｄ ６５．１％（２８／４３）ｉｎ ４３ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ
ｔｈｏｓｅ ａｄｉａｃｅｎｔ
ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ＣＲＴ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ
ｎｏｎ—
ｗａｓ
ａｌＳＯ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｄｊａｃｅｎｔ
【关键词】
癌，肝细胞；免疫球蛋白重链结合蛋白；钙网蛋白；转移
基金项目：国家自然科学基金（Ｕ１２０４８１５）；河南省高校科技创新人才支持计划（１４ＨＡＳＴＩＴ０３０）
Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｉｏｂｕｌｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ
ｃａｎｃｅｒ
１００％（１９／１９），８４．２％（１６／１９），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ
ｗａｓ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｎｏｎ－ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ７５．０％（１８／２４），５０．０％（１２／２４）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ （Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｐ ａｎｄ ＣＲＴｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ（ｒ＝０．３８２，Ｐ＜０．０５）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｎｏｎ—ｃａｎｃｅｒ
ｔｉｓｓｕｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ
ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ａｄｊａｃｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ（尸＜０．０５）．Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ Ｂｉｐ
ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ
Biblioteka Baidu
ａｎｄ ＣＲＴ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ
史堡匿生盘查！Ｑ！！生！旦！！旦筮！！鲞筮！Ｑ塑盟！！！丛型』￡！ｉ塑：丛！竺！！！，！！！！：！！！：！！：盟！：！Ｑ
７６７・
．肝月旦月中瘤
免疫球蛋白重链结合蛋白和钙网蛋白
在肝细胞癌中的表达与转移的关系
傅哲 叶健文唐文超王刚 唐红卫 闰冰冯若
【摘要】
目的探讨免疫球蛋白重链结合蛋白（Ｂｉｐ）和钙网蛋白（ＣＲＴ）在肝细胞癌中的表达
Ｂｉｐ
和ＣＲＴ在肝癌细胞株及肝细胞癌组织中高表达，在肝细胞癌组织中总的阳性表达率分别为８６．０％ （３７／４３）和６５．１％（２８／４３），Ｂｉｐ在转移组高表达率为１００％（１９／１９），明显高于非转移组的７５．０％ （１８／２４），两者比较，差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＣＲＴ在转移组高表达率为８４．２％（１６／１９），明显 高于非转移组的５０．０％（１２／２４），差异有统计学意义（尸＜０．０５）且两者表达呈正相关；Ｂｉｐ阳性率及 表达量与肝细胞癌的ＴＮＭ分期，转移相关（均Ｐ＜０．０５），ＣＲＴ阳性率及表达量均与肝细胞癌的转移 相关（Ｐ＜０．０５）。结论Ｂｉｐ和ＣＲＴ的表达与肝细胞癌的转移相关，对肝细胞癌患者预后的监测有潜 在意义。
ｒａｔｅ
ａｎｄ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｐ ｗｅｒｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＴＮＭ ｓｔａｇｅ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｆｌ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０３７６－２４９１．２０１６．１０．００４
作者单位：４５００５２郑州大学第一附属医院肝胆胰外科，河南省高等学校肝胆胰外科与消化器官移植重点实验 室（傅哲、叶健文、唐文超、王刚、唐红卫、闫冰）；郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室（冯若） 通信作者：冯若，Ｅｍａｉｌ：ｆｒ＠ＺＺＨ．ｅｄｕ．ｃｎ
ｎｏｎ．ｃａｎｃｅｒ
ｄｅｔｅｃｔ
ｃａｓｅｓ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｈｅｐａｔｏｅｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ，ａｄｉａｃｅｎｔ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ
ｃａｒｃｉｎｏｍａ
ｃａｎｃｅｒ
ｔｉｓｓｕｅｓ．５ Ｔｈｅ
ａａｊａｃｅｎｔ ｌｉｖｅｒ ｈｅｍａｎｇｉｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ
万方数据
主堡匡堂盘查垫！鱼生！旦！！旦筮！！鲞筮！Ｑ塑盟堕！丛鲤』ｇ！ｉ塑：丛！丝！！！：！Ｑ！！ｔ！！！：！垒：塑！：！！
ｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｒａｔｅ
ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｉｓｓｕｅｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．
ＩｇＧ（１：３ ０００稀释）、驴抗小鼠ＩｇＧ（１：３ ０００稀释）购 自美国Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。ＰＶ－９０００二步法免疫组织
ｈ，用ＥＣＬ化学发光液在暗室进行曝光，Ｂ．肌动蛋
白（ａｃｔｉｎ）作为内参，用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ图像软件分析灰
度值。
３．实时荧光定量ＰＣＲ：按照ＲＮＡ提取试剂盒 操作，分别提取总ＲＮＡ，测定ＲＮＡ浓度及纯度后， 逆转录ＰＣＲ，合成ｃＤＮＡ，以不同细胞ｃＤＮＡ为模版， 按照试剂合操作说明进行实时荧光定量ＰＣＲ（引物 序列见表１），采用２““‘法分析目的基因ｍＲＮＡ的
株ＳＭＭＣ７７２１、ＨｅｐＧ２、Ｂｅｌ７４０２、ＭＨＣＣ９７Ｈ购于中
脱脂奶粉封闭２ ｈ，一抗４℃孵育过夜，磷酸盐缓冲
液（ＰＢＳ）漂洗６次，５ ｍｉｎ／次，室温孵育相应二抗
１
国科学院上海细胞库。收集２０１４年６月至２０１５年 ５月在郑州大学第一附属医院肝胆胰外科住院患者 的手术标本，其中４３例为肝细胞癌组织及距相应瘤 体２ ｃｍ以上的癌旁组织，５例为正常肝脏组织（肝 血管瘤切除的瘤旁组织，均无肝炎、肝硬化表现）， 实验设计及取材经郑州大学第一附属医院医学伦理 委员会批准。所有患者术前未接受放化疗，临床资 料完整，术后病理诊断明确。本例癌组织患者中男 ３４例，女９例，年龄４２～８０岁，平均年龄为（５７．４± ９．７）岁。根据有无肝内外转移将肝细胞癌组织标 本分为转移组（１９例）和非转移组（２４例）。 ２．试剂和材料：青、链霉素购自美国Ｓｉｇｍａ公 司，ＤＭＥＭ购自北京赛默飞公司，胎牛血清购自美 国Ｇｉｂｃｏ公司，兔抗人Ｂｉｐ多克隆抗体 （１：１ ０００稀释）、鼠抗人ＣＲＴ多克隆抗体（１：１ ０００ 稀释）购自美国Ａｂｃａｍ公司，鼠抗人Ｂ．ａｃｔｉｎ单克隆 抗体（１：５ ０００稀释）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，驴抗兔